Почва — очень благоприятная среда для развития микроорганизмов. Микробиологический почвенный комплекс участвует в процессах формирования специфических органических соединений, круговорота наиболее значимых биогенных элементов (азота, серы, фосфора, углерода) и в процессах самоочищения. В почве обнаруживаются практически все известные таксонометрические группы микроорганизмов: бактерии, актиномицеты, грибы, вирусы, сине-зеленые водоросли, простейшие и т. д. В зависимости от типа почв общее содержание микроорганизмов в 1 г может достигать 6 млрд. клеток [1].
Особенностью распространения бактерий в почве является их высокая локализация в ризосфере (прикорневой зоне растений) и очаговая локализация по почвенному профилю. Каждый почвенный горизонт содержит специфические группировки микроорганизмов со сходными экологическими потребностями.
На качественный состав почвенного микробиоценоза влияет тип почвы, содержание и концентрация различных органических веществ, влажность, видовой состав растительности, аэрация и антропогенные воздействия. Наиболее опасным видом антропогенного воздействия на почвенную экосистему, вызывающим снижение ее биогенной продуктивности и способность выполнять основные функции — является загрязнение.
Загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами является глобальной экологической проблемой. Основными источниками загрязнения почвенной экосистемы сырой нефтью или нефтепродуктами являются такие промышленные объекты как: объекты нефтедобычи и первичной переработки нефти, нефтебазы, парки готовой продукции, трубопроводы, а так же железнодорожный и автотранспорт. Однако, загрязнение окружающей среды углеводородами нефти и наиболее тяжелые последствия чаще всего возникают в результате аварий.
Непосредственно после попадания в почву сырая нефть подавляет развитие большинства групп микроорганизмов, а в процессе биодеградации углеводородов нефти при обогащении почвенной среды продуктами распада формируются анаэробные условия и структура почв, отрицательно влияющие на естественные биохимические процессы, определяющие почвенное плодородие [1, 2].
Мы проводили бактериологический анализ нефтезагрязненных почв с различной начальной концентрацией углеводородов на наличие санитарно-показательных микроорганизмов.
Выбор микроорганизмов для характеристики санитарного состояния почв был сделан на основе известных данных об изменениях в почвенном микробиоценозе в зависимости от различных факторов (присутствие кислорода, наличие загрязняющих веществ). В почвах присутствуют различные группы микроорганизмов, имеющих существенное различие в типе дыхания. Обнаруживаются не только аэробные и анаэробные формы, но и факультативные анаэробы, микроаэрофилы и облигатные анаэробы.
К факультативным анаэробам относятся бактерии, способные развиваться как в присутствии, так и в отсутствии кислорода. Большинство патогенных и сапрофитных почвенных микроорганизмов является факультативными анаэробами (семейство кишечных бактерий Enterobacteriaceae, патогенные стафилококки, палочка протея, клостридии). Микроаэрофилы нуждаются в небольших количествах кислорода и в основном представлены актиномицетами, бруцеллами, лептоспирами. Присутствие кислорода оказывает отрицательное воздействие на облигатных анаэробов, является фактором, резко тормозящим их рост и развитие. Облигатными анаэробами являются клостридии столбняка, анаэробной инфекции, ботулизма.
Для исследования использовали образцы ставропольского чернозема, загрязненного сырой нефтью ставропольских месторождений. Концентрация углеводородов в почве составляла 1, 3, 5, 7 и 10 г/кг, а в качестве контроля применяли незагрязненный чернозем. Для всех образцов нефтезагрязненных почв определялись количество мезофильных аэробных факультативных и анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) и наличие санитарно-показательной микрофлоры, в том числе, бактерий группы кишечных палочек (БГКП), а также бактерий рода сальмонелл, протеев и плесневых грибов. Все опыты проводились в трехкратной повторности согласно стандартным методикам [3, 4].
При определении КМАФАнМ можно получить представление об общем содержании микроорганизмов в пробе. Этот показатель не может быть индикатором присутствия или отсутствия в пробе патогенных микроорганизмов. В контроле КМАФАнМ составило 19·103–20·103 КОЕ/г почвы. В образцах свежезагрязненной почвы численность микрофлоры не зависела от концентрации внесенной нефти и соответствовала полученному в контрольном образце количеству, т. е. 19·103–20·103 КОЕ/г почвы. Через двое суток в этих образцах численность микроорганизмов незначительно сокращалась до 18·103–19·103 КОЕ/г, причем снижение общей численности микробной популяции также не зависело от концентрации углеводородов в почве. Через 7 дней для всех свежезагрязненных образцов было отмечено минимальное КМАФАнМ, прослеживалась зависимость численности микрофлоры от начальной концентрации нефти в почве: с ее увеличением общее количество микрофлоры уменьшалось. На 14 и 21 сутки во всех исследованных образцах обнаруживался рост общей численности микрофлоры с различной интенсивностью, одновременно с этим увеличивалось количество анаэробных микроорганизмов.
Бактерии группы кишечной палочки имеют широкое распространение в природе, хотя основная среда обитания — кишечник птиц, животных. Обнаружение этих бактерий в исследуемой пробе — индикатор загрязнения исследуемой среды фекальными массами.
Имеются принципиальные различия при определении санитарно-показательного значения отдельных родов БГКП. Обнаружение в пробах почвы бактерий рода Citrobacter и Enterobacter является свидетельством давнего фекального загрязнения среды, тогда как присутствие пробах Escherichia указывает на свежее загрязнение. Большое значение имеют, в частности, E. coli, присутствие которых указывает на возможное наличие патогенной микрофлоры. Почва является благоприятной средой для развития патогенной микрофлоры, при этом значение коли-титра ≤ 0,9 свидетельствует о бактериальном загрязнении почвы, а 0,09 — показатель ее сильного загрязнения.
Сальмонеллы относятся к грамотрицательным бактериям семейства Enterobacteriaceae, способны сбраживать углеводы и спирты. Большинство сальмонелл подвижны, не образуют капсул, при культивировании на жидких средах дают диффузное помутнение, а при использовании дифференциальных лактозосодержащих сред имеют бесцветные колонии. Они широко распространены в природе, легко адаптируются к самым различным условиям, большинство их патогенны. Это факультативные анаэробы, попадающие во внешнюю среду с отходами жизнедеятельности человека и животных. В незагрязненной среде сальмонеллы погибают в течение нескольких суток, однако в загрязненной почве могут сохраняться длительное время. Присутствие сальмонелл в исследуемых пробах может быть косвенным свидетельством загрязнения почв фекалиями животных, птичьим пометом или плохо обработанными органическими удобрениями.
Бактерии рода протеев относятся к санитарно-показательным микроорганизмам, патогенным для человека. Их относят к грамотрицательным, споронеобразующим, факультативно анаэробным бактериям, а обнаружение P. vulgaris принято рассматривать как показатель загрязнения объекта органическими веществами причем чаще всего эти микроорганизмы обнаруживаются в гниющих остатках. Высокая обсемененность почв неспорообразующими микроорганизмами рассматривается как признак экологического неблагополучия [1, 3].
В контрольном образце коли-титр был равен 1, что соответствует незагрязненной среде, не были обнаружены анаэробные микроорганизмы P. vulgaris и сальмонеллы. Непосредственно после внесения нефти в почву в загрязненных образцах наблюдалось угнетение микроорганизмов всех видов, в том числе и санитарно-показательных. Во всех образцах свежезагрязненной почвы количество БГКП не превышало допустимых значений, не были обнаружены бактерии родов Proteus и Salmonellа.
Бактериологические исследования повторили на 2, 7, 14 и 21 сутки. Уже на 7 сутки коли-титр соответствовал бактериальному загрязнению почвы, а на 21 сутки был равен 0,09. Количество обнаруженных клеток P. vulgaris возрастало с увеличением концентрации нефти в образцах и давностью углеводородного загрязнения. При концентрации нефти 5 г/кг на 14 сутки было обнаружено максимальное количество клеток — 90 КОЕ/г.
Наибольшая величина КМАФАнМ 3,2·104 КОЕ/г почвы наблюдалась при начальной концентрации нефти 1 г/кг и давности загрязнения 21 день. Увеличение начальной концентрации нефти в почве и повышение давности загрязнения способствовало накоплению бактерий рода Salmonellа (Salmonella spp.) — до 1,1·105 КОЕ/г почвы.
Высокое содержание плесневых грибов в почвах ухудшает их санитарное состояние и является неблагоприятным фактором. В исследованных образцах плесени были обнаружены только в пробах почвы с начальной концентрацией нефти 1, 3 и 5 г/кг, причем обнаруживалось от 1 до 2 колоний плесени. При повышении концентрации нефти до 7 г/кг в двух образцах из трех плесени обнаружено не было, а в одном — 1 колония. В посевах почвы с содержанием нефти 10 г/кг колоний плесени обнаружено не было. Таким образом, непосредственно после попадания в почву углеводороды нефти подавляют развитие плесеней. Однако в процессе биодеградации углеводородов при обогащении почвенной среды продуктами распада создаются условия для развития плесневых грибов.
Таким образом, присутствие углеводородов не столько изменяет качественный и количественный состав микрофлоры нефтезагрязненного субстрата, сколько ухудшает санитарные показатели почв. В связи с этим актуален поиск эффективных способов подавления развития санитарно-показательных микроорганизмов биотехнологическими методами.
Литература:
1. Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы. — М.: МГУ, 1987. — 256 с.
2. Гузев В. С., Левин С. В. Техногенные изменения сообщества почвенных микроорганизмов // В кн. «Перспективы развития почвенной микробиологии». — М.: МАКС Пресс, 2001. — С. 178–219.
3. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М. О. Бюргер. — М.: Медицина, 1973. — 456 с.
4. Теппер Е. З., Шильникова В. К., Переверзева Г. И. Практикум по микробиологии. — М.: Колос, 1979. — 216 с.
5. Смольникова В. В. Влияние метода очистки почв на санитарное состояние нефтезагрязненной территории // Современная лаборатория (Украина, Днепропетровск). — № 2. — 2010. — С. 42–45.
