Установление видовой принадлежности биологических объектов (случай из практики)

Проблема, которая может возникать при определении видовой принадлежности филогенетически близких животных — перекрестная реакция. Существует несколько способов решения этой проблемы. На примере случая из практики биологического отделения Бюро судебно-медицинской экспертизы Чувашии хотим обсудить доступные на сегодняшний день методики и перспективы использования достижений современной науки для видовой идентификации животных.

Ключевые слова: видовая принадлежность биологических объектов, перекрестная реакция, дифференцировка белков филогенетически близких животных, реакция торможения преципитации в агаре.

A problem that may arise in determining the species belonging to phylogenetically close animals is a cross-reaction. There are several ways to solve this problem. On the example of a case in the biological department of the Bureau of Forensic Medical Examination of Chuvashia, we would like to discuss the methods available today and the prospects for using the achievements of modern science for species identification of animals.

Keywords: species affiliation of biological objects, cross reaction, differentiation of proteins of phylogenetically close animals, precipitation inhibition reaction in agar.

Охрана, контроль и регулирование использования объектов животного мира и среды их обитания — одно из важнейших направлений деятельности Министерств природных ресурсов и экологии, направленное на недопущение нарушения установившегося экологического равновесия [1] с установкой нормативов допустимого изъятия охотничьих ресурсов [2]. Определен перечень особо ценных в хозяйственном отношении объектов животного мира, отнесенных к объектам охоты [3–5]. За незаконную охоту предусмотрена уголовная ответственность [6] (только в 2020–2022 гг. в РФ за незаконную охоту осуждено 928 человек [7]). В 2020–2022 гг. в охотничьих угодьях Чувашии выявлено 292 подобных преступления, а в результате дорожно-транспортных происшествий на территории республики за этот же период погибло 154 диких животных [8, 9].

В случаях неочевидности преступных деяний для полноты доказательной базы назначаются судебно-биологические экспертизы с целью установления видовой принадлежности биологических объектов. Так, в биологическом отделении Республиканского Бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Чувашии за период 2020–2022 выполнена 41 подобная экспертиза.

При производстве видовых экспертиз судебно-медицинский эксперт сталкивается с тем [10], что обычные преципитирующие сыворотки не являются специфичными только для одного вида животных, они позволяют дифференцировать филогенетически близкие виды животных только по скорости наступления реакции, которая в значительной степени зависит от концентрации исследуемого белка-антигена.

Для решения данной проблемы при производстве видовых экспертиз предложено несколько методик: сравнительная реакция преципитации в агаре, реакция торможения и встречный иммуноэлектрофорез. Сулейманова Г. М. [11], проводя сравнительный анализ, считает их «простыми и объективными методами дифференцирования крови филогенетически близких видов животных» и дает им такую характеристику: иммуноэлектрофорез — менее чувствительный, более трудоемкий и требующий большего количества преципитирующих сывороток; реакция торможения преципитации — наиболее чувствительна, обладает высокой разрешающей способностью; сравнительная реакция преципитации в агаре — обладает достаточной чувствительностью и разрешающей способностью, требует меньше времени, чем реакция торможения преципитации [12].

Следует отметить, что на современном этапе существует генетический способ определения видовой принадлежности биологических объектов, основанный на определении штрихкода ДНК. В 2004 году стартовал международный проект штрихкодирования жизни (International Barcode of Life — iBOL) по созданию базы данных (библиотеки ДНК-баркодинга) для максимально возможного числа видов живых организмов. Баркодирование ДНК, или ДНК-штрихкодирование — это новый метод каталогизации биологического разнообразия, основанный на том, что каждый из существующих видов живых организмов можно однозначно идентифицировать по сравнительно небольшому фрагменту генома. ДНК-штрихкодированию уже подвергнуто более 120000 видов животных [13].

Также описан феномен перекрестной амплификации STR-маркеров (англ. Short tandem repeat). Изучение закономерностей организации ДНК-маркеров и выявление филогенетически информативного полиморфизма единичных нуклеотидов позволит конструировать видоспецифичные праймеры, дающие продукт только в присутствии ДНК данного вида [14].

В литературе описан случай из практической работы экспертов [15], подтверждающий, что при определении видовой принадлежности биологических объектов, не принадлежащих человеку, необходимо помнить о возможности перекрестных реакций с белками биологически близких животных. На экспертизу были представлены дистальные отделы верхних и нижних конечностей, без кожного покрова, при сравнительно-анатомическом анализе которых, был сделан вывод о принадлежности медведю. Перед биологами был поставлен вопрос об их видовой принадлежности. Ввиду отсутствия сыворотки, преципитирующей белки крови медведя, был избран «путь исключения иной видовой принадлежности». Тестирование исследуемого материала проводилось всеми имевшимися в арсенале видовыми сыворотками методом встречного иммунного электрофореза. В результате получена отчетливая полоса преципитации с антисывороткой против белков крови собаки. Для подтверждения результатов исследований проведено определение видовой принадлежности заведомо известной крови медведя, высушенной на марлевой салфетке, тем же методом. Был получен аналогичный результат: наличие полосы преципитации с антисывороткой против белков крови собаки и отсутствие таковой со всеми другими антисывороткам, на чем и основывалось экспертное заключение о принадлежности исследуемых объектов медведю.

Хотим добавить, что дополнительно можно было применить реакцию торможения преципитации в агаре: для насыщения агара антигеном использовать сыворотку заведомой крови собаки. Если исследуемый биологический материал собаке не принадлежит, то в реакции торможения преципитации должен получиться отрицательный результат с антисывороткой против белков крови собаки, что позволяет исключить принадлежность собаке, и склоняет выводы к видовой принадлежности «медведь» с совокупным учетом данных сравнительно-анатомического анализа.

В биологическом отделении Бюро судебно-медицинской экспертизы Чувашской Республики обозначенная проблема при выполнении видовой экспертизы была решена следующим образом. В ноябре 2020 года поступило постановление о назначении судебно-биологической экспертизы по поводу незаконной добычи лося. В качестве вещественных доказательств были предоставлены бескостные куски замороженного мяса, охотничий нож с чехлом и рулон пластиковых мешков для мусора. Необходимо было определить видовую принадлежность мяса и предполагаемых следов крови на исследуемых предметах. Наличие крови устанавливали методом тонкослойной хроматографии, а ее вид — реакцией преципитации в агаровом геле с использованием всех имеющихся в отделении видовых преципитирующих сывороток. При учете результатов оказалось, что полосы преципитации образовались не только с сывороткой, преципитирующей белки крови лося, но и с сывороткой, преципитирующей белки крови крупного рогатого скота. После стандартных исследований дать однозначный ответ о видовой принадлежности исследуемого биологического материала не представлялось возможным.

Для решения возникшей задачи была выбрана реакция торможения преципитации, описанная Г. И. Абелевым, как метод в иммунологии для выяснения сходства и различия антигенных комплексов [16]. В судебно-медицинской экспертизе эта методика описана Чарным В. И. [17]. Сущность ее сводится к следующему: в агар добавляют избыток антигена, реакцию с которым хотят исключить. При последующем проведении преципитации полосы преципитата образуются только с антигенами, отличающимися некоторыми компонентами от антигена, введенного в агар. С антигеном, идентичным находящемуся в агаре, реакция преципитации не наступает, так как при избытке антигена в агаре образуется растворимый комплекс антиген-антитело, который не препятствует преципитации антителами других антигенов.

При дифференцировке видовой принадлежности в первую очередь необходимо было исключить принадлежность крупному рогатому скоту, сывороткой (антигеном) крови которого по авторской методике, проводится предварительное насыщение агара. С целью упрощения исследования и сокращения его времени, мы использовали сухой образец крови крупного рогатого скота в виде экстракта в физиологический раствор; насыщение — в течение двух суток. Опыт повторен с использованием преципитирующих сывороток, давших ранее положительную реакцию: анти-лось и анти-крупный рогатый скот. При повторной реакции наличие полосы преципитации отмечено только между исследуемым материалом и сывороткой, преципитирующей белки крови лося. Так, удалось исключить принадлежность исследуемых объектов крупному рогатому скоту.

Таким образом, методика, предложенная еще в прошлом столетии, применима в настоящее время и позволяет успешно решать экспертные вопросы. На сегодняшний день в условиях стандартной биологической лаборатории Бюро судмедэкспертизы для установления видовой принадлежности животных можно с успехом применять реакцию преципитации в агаре, а в случае «перекрестных реакций» — реакцию торможения преципитации в агаре с целью дифференцировки филогенетически близких видов животных.

Литература:

1. Об утверждении заключения экспертной комиссии государственной экологической экспертизы по материалам, обосновывающим лимит и квоты добычи лося и косули сибирской на территории Чувашской Республики на период с 1 августа 2023 года до 1 августа 2024 года: приказ Министерства природных ресурсов и экологии Чувашской Республики от 09 июня 2023 г. № 452. URL: https://minpriroda.cap.ru/news/2023/06/09/eksperti-minprirodi-chuvashii-opredelili-limit-i-k (дата обращения: 24.08.2023 г.)
2. Об утверждении нормативов допустимого изъятия охотничьих ресурсов, нормативов биотехнических мероприятий и о признании утратившим силу приказа Министерства природных ресурсов и экологии Российской Федерации от 25 ноября 2020 г. N 965: приказ Министерства природных ресурсов и экологии РФ от 27 января 2022 г. N 49. URL: https://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/403443030/ (дата обращения: 24.08.2023 г.)
3. Об утверждении Перечня объектов животного мира, отнесенных к объектам охоты, которые отнесены к особо ценным в хозяйственном отношении: приказ Минсельхоза РФ от 28.04.2005 N 70 (ред. от 07.11.2006) URL: https://base.garant.ru/5221681/ (дата обращения: 24.08.2023 г.)
4. Об утверждении Методики исчисления размера вреда, причиненного охотничьим ресурсам: приказ Министерства Природных ресурсов и экологии Российской Федерации от 8 декабря 2011 г. N 948. URL: https://base.garant.ru/70132926/ (дата обращения: 24.08.2023 г.)
5. Прокурор разъясняет. Нормативное регулирование охоты от 20 июня 2020 года: официальный сайт прокуратуры Челябинской области. URL: https://epp.genproc.gov.ru/ru/web/proc_74/activity/legal-education/explain?item=49345325 (дата обращения: 24.08.2023 г.)
6. Статья 258. Незаконная охота. Уголовный кодекс Российской Федерации от 13.06.1996 N 63-ФЗ (ред. от 04.08.2023) УК РФ URL: https://base.garant.ru/10108000/ (дата обращения: 24.08.2023 г.)
7. Данные о назначенном наказании по статьям УК. Уголовное судопроизводство. Агентство правовой информации. URL: https://stat.xn----7sbqk8achja.xn--p1ai/stats/ug/t/14/s/17 (дата обращения: 24.08.2023 г.)
8. Результаты деятельности Дирекции за 2021 год от 27.01.2022: официальный сайт Казенного учреждения Чувашской Республики «Дирекция по охране и использованию животного мира и особо охраняемых природных территорий» URL: https://hunt-fish.cap.ru/info.aspx?id=4486648 (дата обращения: 24.08.2023 г.)
9. На совещании инспекторов подведены итоги 2022 года от 23.12.2022: официальный сайт Казенного учреждения Чувашской Республики «Дирекция по охране и использованию животного мира и особо охраняемых природных территорий». URL: https://hunt-fish.cap.ru/Info.aspx?type=news&id=4578403 (дата обращения: 24.08.2023 г.)
10. Реакция преципитации в агаре как метод дифференцирования белков филогенетически близких видов животных/ Чарный В. И. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1964 — № 4. — С. 35–38.
11. Варианты постановки сравнительной реакции преципитации в агаре для дифференцирования крови филогенетически близких животных/ Сулейменова Г. М. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1977 — № 3. — С. 38–40.
12. Сравнительная оценка новых методов дифференцирования крови филогенетически близких видов животных / Сулейменова Г. М. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1977 — № 2. — С. 38–40.
13. Генетическая экспертиза по определению видовой принадлежности животных и растений: официальный сайт АНО «Центр по проведению судебных экспертиз и исследований». URL: https://sudexpa.ru/expertises/geneticheskaia-ekspertiza-po-opredeleniiu-vidovoi-prinadlezhnosti-biologicheskikh-obektov/ (дата обращения: 24.08.2023 г.)
14. Феномен амплификации микросателлитных днк-маркеров в исследовании видов отряда Artiodactyla (парнокопытные)/ С. А. Котова, Е. А. Шило, Е. А. Заблоцкая, Д. Э. Недзвецкая, И. С. Цыбовский// Труды БГУ, 2016 —том 11., часть 2., Обзоры. — С. 56–69. (дата обращения: 24.08.2023 г.)
15. К анализу и интерпретации результатов при установлении видовой принадлежности биологических объектов (случай из практики)/ Кулясова Н. А., Недолуга Н. О. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2018 — № 17. — С. 143–145.
16. Абелев Г. И. Модификация метода преципитации в агаре для сравнения двух систем антиген-антисыворотка // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1960. № 3. С. 118–120.
17. Реакция преципитации в агаре как метод дифференцирования белков филогенетически близких животных (Сообщение 2)/ Чарный В. И. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1967 — № 2. — С. 41–45.