Основы растровой электронной микроскопии и подготовка образцов

В статье автор пытается определить основы растровой электронной микроскопии и подготовку образцов.

Ключевые слова: РЭМ, образец, микроскопия.

Большинство наноматериалов, например, углеродных нанотрубок, нанопроволок, наночастиц и наноструктурированных материалов, можно наблюдать в РЭМ непосредственно путем их фиксации на углеродной проводящей липкой ленте. Подготовка образцов достаточно проста. На некоторые непроводящие наноматериалы, особенно биоорганические, необходимо напылить слой металлического покрытия и подвергнуть их сложному процессу пробоподготовки. В данном разделе будет подробно обсуждаться процедура пробоподготовки биоорганических образцов.

Процедуры получения изображений биоорганических образцов в РЭМ высокого разрешения

Для обеспечения надлежащих рабочих характеристик электронной оптики в колонне РЭМ, пушке и камере образцов должен поддерживаться вакуум порядка 10–6 Торр. Исключением из этого правила являются рабочие условия в камере образцов РЭМ с естественной средой. Высоковакуумные условия являются враждебными для большинства форм жизни вследствие того, что живые клетки и биологические ткани содержат почти 80 % воды. Даже для небольших биомолекул требуется гидратная оболочка для того, чтобы они оставались в своем естественном состоянии. Подобная несовместимость жидких проб, таких как водные растворы, с вакуумной системой электронного микроскопа вынуждает переводить образец в твердое состояние, проводить осушение жидкостей, которые могли бы приводить к дегазации в высоком вакууме и загрязнении колонны микроскопа. Поэтому все жидкие образцы, загружаемые в камеру образцов РЭМ, должны быть осушены для того, чтобы получить стабильное изображение во вторичных электронах. Когда на РЭМ планируется проводить наноструктурные исследования биологических или сольватированных органических систем, необходимость удаления жидкостей значительно влияет на наблюдаемые структуры. Исключением среди условий пробоподготовки образцов путем их сушки является криофиксация и наблюдение при криогенных температурах (криоВРРЭМ — крио-РЭМ высокого разрешения, или cryo-HRSEM — cryo high resolution SEM), который сохраняет водный состав образца в твердом состоянии. В данном разделе мы рассмотрим необходимые этапы перевода биологического образца в твердое состояние (путем его сушки) с минимальными изменениями. Пробоподготовка должна быть достаточно мягкой, чтобы «существенные» детали структуры твердых компонентов в нанометровом масштабе можно было исследовать с помощью РЭМ. Во время испарения растворителя из жидкого образца в газовую атмосферу, как это происходит в случае сушки на воздухе, на поверхность образца действуют большие силы поверхностного натяжения. Это приводит к усыханию и сжатию структур в интервале размеров от 10–3 до 10–6 м, что делает невозможными РЭМ-исследование структур с размерами 1–10 нм. В процессе обычного высушивания на воздухе суспензии красных кровяных телец в воде силы поверхностного натяжения оказываются такими сильными, что разглаживают белые кровяные тельца до такой степени, что на их поверхности уже становится невозможным различить какие-либо структуры. Интересным исключением являются красные кровяные тельца, имеющие предельно гладкую поверхность, на которой не выявляется никаких структурных изменений в субмикронном интервале после сушки на воздухе. Однако молекулярные детали в интервале размеров от 1 нм до 10 нм будут сглажены силами поверхностного натяжения.

При использовании РЭМ в биомедицинских исследованиях электронный микроскоп служит в основном для регистрации характеристик топографии обработанной поверхности образца. Неорганические твердые вещества легко напыляются или фиксируются на столике образцов и могут непосредственно наблюдаться в РЭМ при высоких увеличениях, позволяющих увидеть в подробностях их наноструктуру. Более сложная стратегия иммобилизации молекулярных компонентов и структурных особенностей организмов, органов, тканей, клеток и биомолекул заключается в их химической фиксации в твердом состоянии с помощью химических соединений «кросс-линкеров», сшивающих биополимеры, с последующей обработкой их солями тяжелых металлов для повышения удельной массы компонентов. Биологические образцы сначала «фиксируются» с помощью глютаральдегида-диальдегида, который содержит пять атомов углерода. Когда такие молекулы буферизованы, биологическая проба либо поливается этим раствором, либо погружается в него, и он вступает в реакцию с N-концом аминокислот на соседних белках, высвобождая при этом молекулы 2H2 O и перекрестно сшивая пептидные цепочки. Таким образом, останавливается перемещение всех белковых компонентов клеток и тканей. Затем биологические образцы подвергаются «постфиксации» с помощью тетроксида осмия (OsO4), который, по-видимому, взаимодействует с ненасыщенными жирными кислотами, в то время как липиды служат для остановки вращения молекул относительно их связей и высвобождению 2H2 O. Поскольку OsO4 содержит самый тяжелый элемент, он служит для повышения электронной плотности и усиления рассеивающих свойств биологических мембран, которые в противном случае имеют низкий контраст при наблюдении в РЭМ. OsO4 также является красящим агентом, который взаимодействует сам с собой и с другими красящими веществами. Применение красящих агентов для растровой электронной микроскопии высокого разрешения не рекомендуется, поскольку они связывают дополнительные элементы с мембранами, так что при морфологическом разрешении 1–10 нм наблюдаемые структуры искусственно утолщаются и их размеры невозможно измерить с достаточной точностью. Методы окрашивания красиво работают при наблюдении клеточных органелл с промежуточным увеличением.

После фиксации водное содержимое образца перед сушкой замещается промежуточной жидкостью, обычно органическим растворителем, таким как этанол или ацетон. Для сушки на воздухе иногда применяют ряд растворителей, например, гексаметилдисилазан (ГМДС, или HMDS), Фреон 113, тетраметилсилан (ТМС, или TMS) и PELDRI II, поскольку они уменьшают величину сил поверхностного натяжения, вызывающих сжатие и усыхание клеток и деталей их поверхностной морфологии. Метод высушивания растворителя на воздухе применяют в надежде избежать более времязатратных методов. Эти растворители имеют очень низкое давление паров, и некоторые из них дают удовлетворительные результаты по фиксации белых кровяных телец при наблюдении в РЭМ на промежуточных увеличениях. Однако этот метод не годится для исследования наноморфологии в РЭМ с высоким разрешением. Поскольку процедура сушки удаляет гидратную оболочку с биоорганических молекул, наблюдается некоторое их сжатие в масштабе 1–10 нм. Наиболее общая схема обезвоживания заключается в использовании погружения образца в серию растворов этанола, либо ацетона с концентрациями 30 %, 50 %, 70 %, 90 % и 100 %, и нескольких промывок в чистом 100 %-м растворителе. Необходимо предпринимать меры предосторожности для того, чтобы не удалить слишком много объемной жидкости и не подвергнуть поверхность образца воздействию воздуха. Хотя, как известно, биологические клетки растягиваются при концентрациях ниже 70 % и сжимаются между 70 % и 100 %, изменение их формы можно контролировать с помощью бивалентных катионов, используемых в фиксирующих буферных растворах или промывочных ваннах. Превосходным методом обезвоживания является линейное градиентное дегидрирование, которое требует сменного устройства для медленного повышения концентрации промежуточной жидкости и служит для снижения осмотического удара и изменения формы образца.

В качестве обзора процедур пробоподготовки теперь рассмотрим методику получения изображения в ВРРЭМ биологически важных морфологических деталей размером 1–10 нм. В работе были представлены критерии в пользу и против метода сублимационной криосушки (СКС, или FD — freeze drying) по сравнению с методом сушки в критической точке (СКТ, или СPD — critical point drying), когда эти методы впервые были тщательно изучены в отношении сохранения деталей биологической структуры при морфологических исследованиях биологических образцов в РЭМ. В резюме этой работы сказано, что при фиксации образцов методом СКТ обычно применяются добавки веществ-криопротекторов (сахарозы и DMSO), которые способствуют уменьшению образования кристаллов льда, но при этом сами могут взаимодействовать с образцом. Фиксированные и обработанные криопротекторами образцы погружались в замороженном состоянии в криогенную жидкость (Фреон-22, пропан или этан) и затем помещались в вакуумную камеру, которая откачивалась до вакуума выше 10–3 Торр, и выдерживались в ней при температурах от –35 °C до –85 °C. При применении метода СКС наилучшим было использование в качестве криопротектора этанола, поскольку он сублимируется в вакууме вместе с образовавшимся льдом. Процедура СКС с последующей разморозкой, которая происходит в вакууме, занимает от нескольких часов до двух дней и приводит к более высокой потере объема образца, чем метод СКТ.

Метод СКТ, разработанный Андерсоном в 1951 г., является наиболее надежной и обычно применяемой процедурой сушки биологических образцов. В этом процессе образцы, которые были химически фиксированы и вода, в которых была замещена промежуточной жидкостью (этанолом или ацетоном), затем замещались переходной жидкостью типа жидкого диоксида углерода (CO2), которая подвергалась фазовому переходу в газообразное состояние в камере при повышенном давлении. Процесс СКТ происходит не без потери объема образца и линейного усыхания; однако в этом процессе отсутствуют силы поверхностного натяжения в критической точке (T = 31,1 °C, P = 1,073 \для CO2), определяемой температурой Т и давлением Р. Исследования, проведенные в 1980-х гг., показали, что линейный градиент дегидратации с последующими «процедурами тонкой обработки» для СКТ может существенно снижать усыхание образцов, которое наблюдалось в ранних экспериментах. Контроль расхода газа, выходящего из камеры установки сушки в процессе замещения промежуточной жидкости переходной жидкостью, и контроль температуры переходной жидкости от температуры замещения (4–20 °C) до температуры переходной жидкости (31,1 °C) заметно снижают линейное усыхание и сжимание образцов. Субклеточные структуры, такие как поверхностные микровпадины диаметром 100нм или изолированные везикулы, покрытые калатрином, почти сохраняют свои исходные форму и размер. Разнообразие биологических образцов, изучаемых в РЭМ, велико, и поэтому необходимые стадии обработки изолированных молекул с характерными размерами 1–10нм могут отличаться от тех, которые используются для получения изображений структур размерами 1–10нм в контексте их сложной биологической организации, например, таких структур, как органеллы, клетки, ткани и органы. Имеет смысл применять метод СКТ в качестве пробоподготовки для всех исследований массивных образцов в ВРРЭМ, однако для молекулярных изолятов лучше может работать метод СКС. После обсуждения методов нанесения металлических покрытий с нанометровой точностью для ВРРЭМ приводится протокол метода СКТ для получения изображений органелл размерами ~50–60нм, содержащих тонкие структуры с характерными размерами 1–10нм в контексте массивного образца (размерами больше 1 мм3), исследуемого с помощью ВРРЭМ, и дается сравнение полученных изображений с ПЭМ-изображениями фиксированных тонких срезов, залитых в смолу.

Биологические образцы по своей природе состоят из элементов с низким атомным весом, которые, естественно, при возбуждении их электронным пучком имеют низкий коэффициент эмиссии вторичных и отраженных электронов. Эти углеводородные образцы к тому же являются диэлектриками и часто заряжаются под пучком. С самого начала исследования биологических образцов в РЭМ использовался метод вакуумного напыления благородных металлов на образцы для придания им электропроводности. Такие металлы делают образцы проводящими, но тепло, излучаемое при напылении, приводит к тому, что горячие металлы внедряются в поверхность образца. Магнетронное осаждение таких металлов (золота, серебра, золота/палладия и платины) в атмосфере аргона уменьшает повреждение поверхности биоорганических образцов, но все же приводит к декорированию структуры большими зернами металлической пленки неоднородной толщины. Благородные металлы не подходят для пробоподготовки образцов для их исследования в ВРРЭМ вследствие большого размера зерен напыляемой пленки и большой подвижности: по мере того как зерна золота или других благородных металлов напыляются на образец, они стремятся мигрировать в направлении других зерен и сливаются друг с другом, наращивая пленку металла вблизи самых высоких морфологических деталей поверхности образца, приводя к ее «декорированию». Таким образом, некоторые структуры могут оказаться «перенапыленными», в то время как другие участки поверхности могут не иметь пленочного покрытия, что приводит к образованию островковых пленок. Кроме эффектов декорирования крупнозернистыми (2–6 нм) пленками металла наличие больших зерен благородных металлов увеличивает эффект рассеяния первичных электронов, приводя к повышенному коэффициенту эмиссии вторичных электронов и появлению вторичных электронов типа ВЭ-II и ВЭ-III. В противоположность эффекту декорированных металлических пленок, сверхмалые зерна металлов (Cr, Ti, Ta, Ir и W) имеют очень малую подвижность и моноатомную зернистость пленок. Эти металлы образуют не «декорации», а ровные «покрытия», поскольку атомные зерна остаются вблизи участков, на которых они были осаждены, образуя сверхтонкую сплошную пленку с малой «критической» толщиной, зачастую d1 нм. Малая зернистость этих металлов существенно повышает коэффициент эмиссии вторичных электронов первого типа ВЭ-I, обеспечивающих высокое разрешение, поскольку рассеяние первичных электронов в металлической пленке является ограниченным. Получающиеся изображения демонстрируют великолепное морфологическое разрешение с высокой точностью вплоть до нескольких нанометров, поскольку данная пленка дает ровное покрытие толщиной 1–2 нм по всему контуру образца.

1. O. C. Wells, Scanning Electron Microscopy, McGraw-Hill — New York, 1974.
2. S. Wischnitzer, Introduction to Electron Microscopy, Pergamon Press — New York, 1962.
3. M. E. Haine and V. E. Cosslett, The Electron Microscope, Spon — London, 1961.
4. A. N. Broers, in: SEM/1975, IIT Research Institute — Chicago, 1975.
5. J. Goldstein, D. Newbury, D. Joy, C. Lyman, P. Echlin, E. Lifshin, L. Sawyer, and J. Michael, Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis, 3rd edn, Kluwer Academic/Plenum Publishers — New York, 2003.
6. C. W. Oatley, The Scanning Electron Microscope, Cambridge University Press — Cambridge, 1972.
7. J. I. Goldstein and H. Yakowitz, Practical Scanning Electron Microscopy, Plenum Press — New York, 1975.
8. Y. X. Chen, L. J. Campbell, and W. L. Zhou, J. Cryst. Growth — 2004.