Регуляция длины теломер играет важную роль в плюрипотентных стволовых клетках многоклеточных организмов, так как она обеспечивает развитие и выживание особи. Теломеры представляют собой повторяющуюся ДНК, которые постепенно утрачиваются в результате каждого клеточного деления. Когда теломеры достигают критически короткой длины, они активируют ответ на это — разрушение ДНК, в результате которого клеточный цикл останавливается. Чтобы противодействовать изнашиванию теломер, плюрипотентные стволовые клетки оснащены механизмами продления жизни теломер. Эти механизмы обеспечивают клетку бóльшими количествами деления и самообновления. Чрезмерное удлинение также может быть опасным; ему противодействуют механизмы быстрой делеции теломер, названные триммингом теломер (обрезанием). Несмотря на то, что уже установлены последствия критически коротких теломер, механизмы, противодействующие чрезмерной элонгации (удлинения), только начинают быть понятными.
Ключевые слова : теломера, шелтерин, стволовая клетка, тримминг теломер, ZBTB48, TZAP.
Теломеры — жизненно важные структуры нуклеопротеидов, задачей которых является «покрыть» и защитить хромосомные концы. Теломеры млекопитающих состоят из повторяющихся последовательностей — [ТТАГГГ]n, которые являются местом прикрепления белкового комплекса для защиты. Этот комплекс получил название шелтерин. Шелтерин — это комплекс из шести белков, содержащий 2 прочно связанных между собой белка TRF1 и TRF2. Они, в свою очередь, крепят остальную часть комплекса (TIN-2-TPP1-POT1 и RAP1) к концам хромосом. Шелтерин закручивает ДНК «в лассо» — т-образную петлю, которая появляется в результате проникновения одноцепочечного 3' теломерного выступа в двуцепочечную теломерную часть. Т-образные структуры, а также связывание шелтерина, обеспечивает конец хромосомы защитой от нуклеолитической деградации и ответной реакции повреждения ДНК [1]. Постепенное уменьшение теломер связано с делением клетки. Это происходит по той причине, что ДНК-полимеразы не способны к полной репликации линейной матрицы — так называемая проблема с концевой репликацией. В результате, в реплицирующихся клетках, теломеры претерпевают «истирание», если не противодействовать механизмами удлинения. Далее, теломеры достигают критической длины, и уже не содержат достаточного количества шелтерина. Длина теломер — главный фактор, определяющий потенцию к делению клетки, такими, например, клетками, не имеющими механизмов, обеспечивающих достаточное удлинение, могут быть соматические клетки.
Удлинение теломер обеспечивается теломеразой — ферментом, образованным обратной транскриптазой TERT и РНК матрицей, TERC, наряду со связанными белками — рибонуклеопротеином Дискерина. Теломераза способна de novo добавлять ТТАГГГ повторы к концам хромосом, что позволяет пополнить конечные последовательности, которые были потеряны из-за проблем с репликацией на конце. Таким образом, удлинение теломер в стволовых и зародышевых клетках особенно важно для обеспечения достаточного количества клеточных делений, а оно, в свою очередь для нормального развития, также для обновления и регенерации тканей. У долго живущих млекопитающих, например, людей, экспрессия теломеразы заблокирована во многих соматических клетках [2]. Совокупность заболеваний человека, связанных с дефектом удлинения теломер, называется Болезни Теломерной Биологии (БТБ, Telomere Biology Disorders, TBD), такое название подчеркивает важность собственной регуляции длины теломер. Люди, страдающие данными заболеваниями, имеют критический уровень длины теломер, и в зависимости от степени тяжести заболевания, имеют симптомы, связанные с дефектной клеточной пролиферацией.
Теломеры могут быть также удлинены теломеразо-независимым способом — рекомбинационным процессом, который называется альтернативным удлинением теломер (АУТ, alternative lengthening of telomeres, ALT). Значительная часть раковых клеток (примерно 15 %) не экспрессируют теломеразу и поддерживают длину теломер АУТом. АУТ задействует механизм гомологичной рекомбинации для использования теломерных последовательностей, в качестве матрицы для удлинения теломер. Довольно интересно, что АУТ так же был обнаружен в малодифференцированных соматических клетках мыши [3]. Кроме того, было установлено, что АУТ-подобные механизмы активны во время ранних стадий эмбриогенеза. В этих случаях, АУТ-подобные функции сопряжены с экспрессией теломеразы. В настоящий момент непонятно, до какой степени эти теломеразо-независимые механизмы способствуют удлинению теломер в нормальных клетках. Последнее, чем удлинение теломер уравновешивается — триммингом теломер. Тримминг активно сокращает длинные теломеры, способные причинить вред стабильности генома [4]. В то время как механизмы, поддерживающие минимальную длину теломер, хорошо изучались на протяжении десятилетий, процессы, поддерживающие максимальный уровень длины теломер остаются достаточно неясными.
Удлинение теломер в плюрипотентных стволовых клетках.
Плюрипотентные стволовые клетки, например, эмбриональные стволовые клетки, способны к самообновлению. Они дают начало фактически всем видам соматических клеток. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) были первыми плюрипотентными стволовыми клетками, которые выделили и культивировали in vitro. Мышиные ЭСК изменили подходы в мышиной генетике, которые основаны на том факте, что ЭСК — «бессмертные», т. е. их можно было генетически модифицировать и использовать для воссоздания любой мыши, даже после того, как эти клетки были культивированы более месяца in vitro. В последнее время, создание культур человеческих ЭСК, так же как и возможность создавать «индуцированные» плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК, induced pluripotent stem cells, iPSCs) из соматических клеток, дают большие надежды в трансплантационной терапии. ЭСК и ИПСК могут удлинять свои теломеры и пролиферировать бесконечно, пока поддерживается плюрипотентность и стабильность генома. Подчеркивает важность гомеостаза теломер в этих клетках то, что ЭСК с короткими теломерами отличают пониженная плюрипотентность и дефекты дифференцировки.
Большое количество механизмов обеспечивают процесс удлинения теломер в ЭСК, включая повышенный уровень теломеразной активности. Интересно, что АЛТ-подобная активность была обнаружена в ЭСК. Однако, учитывая, что истощения теломеразной активности в ЭСК появляется из-за критического укорочения теломер, вклад АУТ-подобного механизма в гомеостаз теломер остается невыясненным.
ЭСК отличаются от всех клеток «открытыми» структурами хроматина с недостаточными уровнями маркеров гетерохроматина H3K9me3 и H4K20me3. Нехватка этих маркеров говорит о том, что теломерный хроматин ЭСК имеет мало- или деспирализованную структуру. Это состояние связано с повышенным уровнем теломеразо-опосредованного удлинения. Действительно, понижение H3K9me3, путем истощения SUV39H1/H2 или понижение уровня H4K20me3, из-за истощения Suv4–20h. Оба они вызывают удлинение теломер [2]. Аналогично, в развитии мышей экспрессия Zscan4 приводит к удлинению теломер, за счет уменьшения метилирования ДНК. Мышиные эмбриональные стволовые клетки не имеют достаточного количества ДНК метилтрансфераз (Dnmt1, Dnmr3a/3b), что способствует удлинению теломер. У пациентов, при нехватке DNMT3b формируются очень короткие теломеры, что приводит к иммунодифициту, нестабильности центромер и лицевым аномалиям — ICF-syndrome [5]. Данное несоответствие можно объяснять специфическими различиями между мышами и людьми с точки зрения регуляции длины теломер или путем дополнительных модификационных факторов, которые способствуют укорочению теломер у пациентов с ICF.
Что интересно, нехватка метилирования может быть также связана с АУТ-подобными явлениями, таким как повышенный уровень обмена теломер между сестринскими хроматидами (telomere sister chromatid exchange. TSCE). Согласно этому тезису, низкие уровни Н3К9me3 и Н4К20me3 также отмечаются в раковых клетках, использующие АУТ, чтобы удлинить теломеры [6]. В раковых клетках АУТ связан с мутациями в ATRX/DAXX преобразующем комплексе и мутацией в гистоновом варианте H3.3. ATRX/DAXX комплекс действует как шаперон, который помещает гистон Н3.3 в перицентрический хроматин, теломеры, а также на остальные сайты гетерохроматина по всему геному [7]. Обобщая, представленные данные демонстрируют четкую связь между статусом хроматина и механизмами удлинения хроматина.
Надобность поддержания нижнего порога длины теломера установлена и ясна, в отличие от важности поддержания верхней границы длины теломер. Первые данные о верхнем лимите длины теломер были получены из анализа S.cerevisiae -штамма, несущего мутантный аллель Rap1. Теломеры данного мутантного штамма были увеличены до 4 kb, в то время как нормальный размер составляет 300 bp. Поразительно, что эти удлиненные теломеры были весьма неустойчивыми, вызывая повышенное число потерь хромосом. Анализ клеток, несущих эти гипер-удлиненные теломеры выявил процесс, названный TRD (Тelomere Rapid Deletions). Он может восстановить чрезвычайно длинные теломеры обратно — в нормальную длину. TRD происходит за счет гомологичной рекомбинации, механически отличающейся от постепенного укорочения теломер, известного как истирания теломер. Генетически, TRD требует гомологичной рекомбинации факторов Mre11 и RAD50. Подавляется он путем концевого-негомологичного-присоединения (NHEJ) фактора Ku70. Позже было показано, мейотические клетки S.cerevisiae претерпевают высокое число точных делеций для поддержания естественного размера теломер, на подобие TRD. В ходе исследования, TRD был в 30–70 раз выше в мейотических клетках, по сравнению с митотическими, что говорит о том, что контроль верхнего предела длины теломер очень важен на этой стадии развития. В S.Pombe, истощение теломер связано с белком Taz1. Это приводит к достаточно крупному удлинению теломер и к дефектам в репликации теломер, так же как частые спутывания теломер. Что интересно, что нехватка taz1 ведет к быстрой потере теломер, по причине того, что имеются проблемы с полуконсервативной репликацией теломерной ДНК, которые в свою очередь могут быть компенсированы теломеразо-опосредованным теломерным удлинением [8].
Процесс, аналогичный дрожжевым TRD, впервые упоминается в клетках млекопитающих, которые экспрессируют аллель теломер-связывающего белка TRF2 с некоторым изменением — TRF Basic . Связывание TRF Basi с с теломерами запускает делецию большого количества повторов теломер, что приводит к быстрому укорочению теломер. Полагают, что вырезанные теломерные повторы, в тех местах, где обнаруживается экстрахромосомные t-сircles, возникают в результате обрезания т-образных петель. Генетически, частота этих делеций теломерных повторов зависит от гомологичной рекомбинации белков XRCC3 и NBS1. XRCC3 является резольвазой, действующей в структурах Холидея, тогда как NBS1 является компонентом MRE-11-Rad50-NBS1 (MRN) комплексa [9]. Это свидетельствует о том, что аналогично тому, как это происходит в дрожжах, в клетках млекопитающих также длина теломер способна восстанавливаться с помощью быстрой делеции. Данное предположение было подтверждено анализом клеток с гипер-удлинением теломер. Высокие уровни теломеразной активности «запускаются» сопутствующей гиперэкспрессией каталитического компонента, hTERT, и РНК компонента. Наличие hTR связано с прогрессирующим удлинением теломер. Однако, когда клетки с высоким уровнем теломеразы были получены в культуре, удлинение теломер в конечном счете остановилось и клетки «запасались» особыми структурами — c-circles, что свидетельствует об быстром истощении теломер. В таком случае, TRD не вызывают дисфункцию теломер, предполагая, что регулируемый процесс вовлечен в регуляцию длины теломер, а сам он назван — триммингом теломер. Похожий механизм был описан в эмбриональных стволовых клетках человека так же, как и в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках с повышенным уровнем регуляции теломеразной активности [10].
Тримминг теломер играет физиологическую роль в зародышевых клетках и активированных Т-клетках, в них осуществляется теломеразная активность. В зародышевых клетках, теломераза активируется до оплодотворения, чтобы удлинить теломеры и обеспечить достаточный уровень длины теломер для «потомка». Аналогично, теломеразное индуцирование в активированных Т-клетках необходимо, чтобы поддерживать обильную клеточную пролиферацию на протяжении иммунного ответа. В обоих случаях, выявляются с-circle структуры, что говорит о том, что тримминг теломер обеспечивает сбалансированный механизм для предотвращения чрезмерного удлинения теломер. В данном случае т-circle структура была упомянута, так как зависит от XRCC3.
Наблюдение за тем, что гипер-удлиненные теломеры могут вызывать резкую делецию, предполагает, что отличия между короткими и длинными теломерами могут выражать верхний предел длины теломер. Один из потенциальных механизмов представлен «разбавлением» специфических факторов при аномальном удлинении теломер. И действительно, это было показано на клетках млекопитающих — избыточность шелтерина не меняется в зависимости от длины теломер. В результате, плотность шелтерина в теломерах обратно пропорционально длине теломер: в коротких теломерах — высокая плотность шелтерина. Согласно данным наблюдениям, мыши с гипер-удлиненными теломерами демонстрируют похожий уровень шелтерина на каждой теломере [11].
Другое отличие между короткими и длинными теломерами заключается в модификации хроматина. Теломерный хроматин млекопитающих обычно «молчит», то есть в репрессивном состоянии, связанный гетерохроматиновым белком 1 (HP1) и с высоким уровнем гетерохроматиновых маркеров H3K9me3 и H4K20me3. Как было сказано выше, изменения, касающиеся хроматиновых маркеров, влияют на теломеразо-опосредованное удлинение. Эти данные говорят о том, что состояние хроматина влияет на возможность теломеразы воздействовать на теломеры и, возможно, эти изменения опосредуют способность клеток участия в быстрой делеции теломер, направленной на изменение длины теломеры. Клетки, которые поддерживают теломеры, используя АУТ, имеют низкий уровень H3K9me3 и H4k20me3 и низкую плотность нуклеосом [6].
Верхний порог длины теломер может быть также обусловлен репликационной остановкой тандемов ТТАГГГ. Теломеры, содержащие данный повтор, имеют естественную тенденцию к образованию G-квадриплекса, который действует как структурный барьер, вызывающий коллапс репликационной вилки. Фактически, теломерные ДНК — склонны к репликационным дефектам, если нет теломер-связанных белков. Это происходит также по той причине, что длинные теломеры наиболее часто задерживаются репликационным сигналом, который может опосредовать их участие в быстрых делециях теломер. Данный факт подтверждается множественными исследованиями, что репликационный стресс связан с накоплением в теломерах с-circles структур. Например, истощение ASF1 — шаперона, гистонового ряда, ответственно за собственную нуклеосомную сборку в течение репликации и приводит к аккумуляции c-сircles. Аналогично, истощение запаса SMARCAL1 — части SWI/SNF-родственных групп ремодуляторов хроматина совместно с геликазой и АТФазой активностью, позволяет увеличиваться репликационной вилке в течение репликации ДНК. Приведенные данные свидетельствуют о том, что остановка вилки репликации действует как триггер для активности тримминга теломер.
Было установлено, цинковый палец — ZBTB48 — является новым специфическим белком, связанным теломерой. Чтобы подчеркнуть его важность, его переименовали в Белок Ассоциированный с Цинковым Пальцем (БАЦП, Telomeric associated zinc finger protein, TZAP). TZAP непосредственно связывается с повторами ТТАГГГ независимо от шелтерина. Известно, что как в самой клетке, так и in vitro, связывание TZAP с хромосомными концами опосредуется прямым взаимодействием между терминальным 3 доменом цинкового пальца TZAP и повторами двойных спиралей теломер. TZAP связываясь с теломерами, может быть перемещен гиперэкспрессией TRF1 и TRF2, и считается, что TZAP и шелтерин соревнуются за связывание с теломерами. В результате данного соревнования, TZAP преимущественно связывается с длинными теломерами, имеющими низкую нагрузку шелтериновым комплексом. Локализация TZAP в теломерах приводит к инициированию быстрого уменьшения последовательностей, что сопровождается также накоплением c-circles. Также считается, что TZAP играет важную роль в тримминге теломер. В доказательство этому, служит то, что низкий уровень TZAP в теломере приводит к малому количеству c-сircles и к повышенной длине теломер в ЭСК мышей.
Каким образом TZAP запускает тримминг? TZAP не содержит иных ферментативных доменов, в таком случае, можно предположить 2 варианта: TZAP будет физически привлекать резольваз, способных к вытеснению т-образной петли, что приводит к эксцизии т-петли и тримиингу теломер. Потенциальными кандидатами резольваз могут служить — SLX4-SLX1-Mus81 или Bloom-ToloIIIa0Rmi1 дизольвазы. Другим возможным способом может быть то, что TZAP может стимулировать или стабилизировать ДНК структуры, которые действуют как субстрат для этих потенциальных факторов. В таком сценарии, TZAP может противодействовать основному домену TRF2, который, как было показано, связывает тринаправленные соединения в основании т-петли для предотвращения расщепления ее HJ-резольвентами. В соответствии с этой моделью верхний порог длины теломеры может быть определен, как баланс между связыванием TZAP и TRF2. Необходимы дополнительные эксперименты для оценки механизма действия TZAP и его потенциальной возможности связывать и стабилизировать структуры теломер ДНК.
Литература:
- Okamoto, K., Bartocci, C., Ouzounov, I., Diedrich, J.K., Yates, J.R., 3rd, Denchi, E.L., 2013. A two-step mechanism for TRF2-mediated chromosome-end protection. Nature 494, 502–505
- Gomes, N.M., Ryder, O.A., Houck, M.L., Charter, S.J., Walker, W., Forsyth, N.R., Austad S. N., Venditti, C., Pagel, M., Shay, J.W., Wright, W.E., 2011. Comparative biology of mammalian telomeres: hypotheses on ancestral states and the roles of telomeres in longevity determination. Aging Cell 10, 761–768.
- Neumann, A.A., Watson, C.M., Noble, J.R., Pickett, H.A., Tam, P.P., Reddel, R.R., 2013. Alternative lengthening of telomeres in normal mammalian somatic cells. Genes Dev. 27, 18–23.
- Pickett, H.A., Cesare, A.J., Johnston, R.L., Neumann, A.A., Reddel, R.R., 2009. Control of telomere length by a trimming mechanism that involves generation of t-circles. EMBO J. 28, 799–809.
- Yehezkel, S., Segev, Y., Viegas-Pequignot, E., Skorecki, K., Selig, S., 2008. Hypomethylation of subtelomeric regions in ICF syndrome is associated with abnormally short telomeres and enhanced transcription from telomeric regions. Hum. Mol. Genet. 17, 2776–2789.
- Episkopou, H., Draskovic, I., Van Beneden, A., Tilman, G., Mattiussi, M., Gobin, M., Arnoult, N., Londono-Vallejo, A., Decottignies, A., 2014. Alternative Lengthening of Telomeres is characterized by reduced compaction of telomeric chromatin. Nucleic Acids Res. 42, 4391–4405.
- Voon, H.P., Hughes, J.R., Rode, C., De La Rosa-Velazquez, I.A., Jenuwein, T., Feil, R., Higgs, D.R., Gibbons, R.J., 2015. ATRX plays a key role in maintaining silencing at interstitial heterochromatic loci and imprinted genes.. Cell Rep. 11, 405–418.
- Miller, K.M., Rog, O., Cooper, J.P., 2006. Semi-conservative DNA replication through telomeres requires Taz1. Nature 440, 824–828.
- Stracker, T.H., Petrini, J.H., 2011. The MRE11 complex: starting from the ends. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 90–103.
- Rivera, T., Haggblom, C., Cosconati, S., Karlseder, J., 2017. A balance between elongation and trimming regulates telomere stability in stem cells. Nat. Struct. Mol. Biol. 24, 30–39
- Varela, E., Munoz-Lorente, M.A., Tejera, A.M., Ortega, S., Blasco, M.A., 2016. Generation of mice with longer and better preserved telomeres in the absence of genetic manipulations. Nat. Commun. 7, 11739.
