Выращивание третьего поколения зубов



Пожалуй, зубы находятся в топ-5 жизненно важных органов человека. Отсутствие или повреждение одного зуба может принести постоянный дискомфорт и боль, с которыми невозможно жить. Заболевания других органов во многих случаях могут не беспокоить долгое время — с ними можно спокойно жить, забыв о дискомфорте, чего не скажешь о зубной боли. Иногда, когда поврежденный зуб не подлежит лечению, врач прибегает к крайним мерам и удаляет зуб. Конечно, без зубов тоже можно жить, но отсутствие даже одного зуба может вывести из строя пищеварительную систему, а вслед за ней и другие. Все вышеперечисленное ― проблемы не новые. Выпадение, вынужденное удаление или генетические болезни, такие как анодонтия, олигодонтия, заставляющие человека страдать от недостатка зубов в течение всей жизни, давно изучаются учеными-стоматологами. Конечно, есть современные технологии, с помощью которых можно поставить имплант, заменив выпавший зуб. Однако имплант не может стать полноценной заменой собственного зуба. Поэтому ученые давно задаются вопросом выращивания зубов у человека, в частности, с помощью стволовых клеток. Стволовые клетки ― это единственный организм, на который можно опираться при регенерации тканей не только зубов, но и остальных органов. Недавние события в Японии, связанные с выращиванием зубов, показали, что будущее у этой техники есть и она набирает популярность.

Ключевые слова: выращивание зубов, третье поколение, имплант, зубы, резцы, Япония, регенерация, стоматология, открытие, лечение, дантисты, эксперименты, человек, ученые, технология, новые зубы, стволовые клетки, мыши, анодонтия, олигодонтия, ген, белок USAG-1.

За последние 15 лет в области биологии развития и биологии стволовых клеток сделаны великолепные открытия, которые показали новые направления понимания процессов формирования зубов и потенциала стволовых клеток. Благодаря этому исследователи смогли осуществить выращивание новых зубов и заняться биоинженерией данного органа. Уже известно, как сигнальные молекулы и гены регулируют развитие зубов, и с использованием трансгенных мышей удалось продемонстрировать возможность формирования новых зубов путем изменения сигнальных сетей, отвечающих за их раннее развитие. Большой прорыв в биологии стволовых клеток был совершен в 2006 году. Тогда было выявлено, что аутологичные клетки пациента могут быть перепрограммированы в плюрипотентные стволовые клетки, что открывает возможности для создания новой ткани и органов [1].

После этого открытия прошло совсем немного времени, и уже в 2023 году ученые продвинулись вперед и окончательно удостоверились, что зубы можно выращивать. Остаются открытыми несколько вопросов. Получится ли такой же хороший результат, если начать использовать препарат на человеке, и не будет ли побочных действий в виде новообразований в области мягких тканей или зубов? Будет ли возможно регулировать форму зубов? При экспериментах сделать это было сложно, учитывая, что у каждого человека форма зубов индивидуальна, хотя есть определенные стандарты (резцы имеют треугольную форму, клыки ― конусообразную и т. д.). Можно ли будет провести повторное лечение в случае повреждения выращенного зуба? Все-таки человеческий организм устроен сложнее, чем организм любых других млекопитающих или животных других классов. Особняком стоят осьминоги ― они еще не до конца изучены, и их образ жизни отличается от остальных [2].

Итак, ученые-стоматологи решили провести уже более обширный эксперимент, чтобы убедиться в эффективности метода. Для этого они собирают добровольцев, больных анодонтией и олигодонтией, чтобы проверить препарат, который ранее был опробован на мышах, и результаты применения которого поразили и дали большой толчок развитию медицины и биоинженерии. Уже скоро, в этом году, начнется ряд экспериментов с участием добровольцев. Если результат будет положительным, то через 5–10 лет (в последнее время технологии развиваются очень стремительно) ученые смогут управлять генами, блокирующими рост зубов. В научной лаборатории считают, что на основании гистологических и молекулярно-биологических исследований выработана новая концепция, согласно которой формирование зачатков вечных зубов, определяющих различное зубное потомство, происходит на апикальном конце непрерывно растущих зубов. Для обозначения этой эпителиальной структуры предлагается новый термин ― «апикальная почка». Кроме того, обсуждается взаимосвязь между сигнальными центрами и экспрессией мРнк FGF-10, которая играет ключевую роль в морфогенезе зубов и конечностей. Исследование экспрессии FGF-10 сосредотачивается на понимании механизмов, определяющих разнообразие острых выступов и рост органов — непрерывный или ограниченный. Основными методами выращивания зубов с практически положительными результатами являются:

– внешняя (in vitro) инженерия;

– внутренняя (in vivo) инженерия;

– тканевая инженерия.

Во всех случаях основным строительным материалом являются стволовые клетки, при этом орган развивается самостоятельно. Если использовать собственные клетки, то появляется риск отторжения тканей. В первую очередь необходимо осуществить забор стволовых клеток. Их можно выделить из:

– молочных зубов;

– зубов мудрости;

– слизистой оболочки полости рта;

– пульпы;

– других органов [3].

Чаще всего забор столовых клеток делают из молочных зубов. Непрерывно растущий мышиный резец является отличной моделью для анализа механизмов происхождения стволовых клеток. Был разработан метод органной культуры апикального конца резца, и проанализировано происхождение эпителиальных клеток с помощью мечения 5-бром-2'-дезоксиуридином и DiI. Результаты показывают, что стволовые клетки находятся в эпителии петли шейки матки, состоящем из центрального ядра клеток звездчатого ретикулума, окруженного слоем базальных эпителиоцитов. Они дают начало потомству, усиливающему транзит и дифференцирующемуся в эмалеобразующие амелобласты. Ученые идентифицировали медленно делящиеся клетки среди Notch1, экспрессирующих клетки звездчатого ретикулума в определенных местах вблизи базальных эпителиоцитов, экспрессирующих лунатическую бахрому, секреторную молекулу, модулирующую сигнализацию Notch.

Из исследований рекомбинации тканей известно, что в резце мыши мезенхима регулирует непрерывный рост эпителия. Экспрессия Fgf-3 и Fgf-10 была ограничена мезенхимой, лежащей в основе базальных эпителиальных клеток, и транзитно-амплифицирующими клетками, экспрессирующими их рецепторы Fgfr1b и Fgfr2b. Когда белок FGF-10 наносили шариками на культивируемый эпителий шейной петли, это стимулировало пролиферацию клеток, а также экспрессию лунатической каймы. Они представляют модель, в которой передача сигналов FGF из мезенхимы регулирует путь Notch в зубных эпителиальных стволовых клетках посредством стимуляции экспрессии lunatic fringe и, таким образом, играет центральную роль в сопряжении митогенеза и решении судьбы стволовых клеток.

Клетки tem присутствуют во многих регенерирующих тканях позвоночных, включая кроветворную систему, нервную систему, кишечник, гонады, кожу и обонятельный эпителий. Стволовые клетки обычно определяются как клетки, обладающие способностью самообновляться, а также давать начало дифференцированному потомству [4].

Было показано, что у беспозвоночных стволовые клетки подвергаются асимметричному клеточному делению, в результате чего одна дочерняя клетка остается в компартменте стволовых клеток, а другая подвергается дальнейшему клеточному делению и дает начало дифференцированным тканям. Прямая идентификация стволовых клеток в большинстве тканей млекопитающих была проблематичной из-за отсутствия специфических маркеров стволовых клеток. Нервные и гемопоэтические стволовые клетки в последнее время стали предметом особого интереса, и мультипотентные нервные клетки, которые могут генерировать новые нейроны и глию, были идентифицированы в эпендимальных клетках желудочков мозга взрослого человека).

Было показано, что эти клетки делятся редко и асимметрично, а другая дочерняя клетка остается в виде недифференцированной стволовой клетки в слое эпендимы, тогда как еще одна клетка перемещается в субвентрикулярный слой и дает начало быстро делящемуся пулу клеток-предшественников, так называемым транзиторно-амплифицирующим клеткам, обеспечивающим источник нейрональных и глиальных предшественников.

Гемопоэтические стволовые клетки были выделены с использованием антител к поверхностным антигенам клеток (Spangrude et al., 1998) [5] и их свойства были продемонстрированы при трансплантации облученным животным-хозяевам в условиях, когда можно идентифицировать потомство единственной стволовой клетки (Morrison et al., 1994) [6].

Недавно из аналогичных экспериментов по трансплантации были представлены доказательства того, что нейрональные стволовые клетки могут обладать способностью давать начало гемопоэтическим клеткам (Бьорнсон и др., 1999) [7]. Молекулярные механизмы, регулирующие поддержание стволовых клеток, их клеточное деление и дифференцировку, остаются в значительной степени неизвестными, но было высказано предположение, что существуют общие механизмы, разделяемые стволовыми клетками в различных тканях, которые лежат в основе их специфических свойств.

Считалось, что поддержание недифференцированного состояния стволовых клеток регулируется межклеточными взаимодействиями, включающими сигнальный путь Notch (Fortini and Artavanis-Tsakonas 1993; Bray 1998, et al.) [8, 9]. Экспериментальных доказательств этого предположения в тканях позвоночных нет, но оно подтверждается данными экспрессии in situ и установленной ролью Notch в регуляции клеточной дифференцировки у беспозвоночных. Было показано, что Notch-рецепторы экспрессируются в недифференцированных нервных клетках, а также в кератиноцитах, но экспрессия не ограничивается только стволовыми клетками. Гемопоэтические стволовые клетки экспрессируют Notch-рецепторы и Notch-лиганд Jagged1. Serrate1 было показано, что стромальные клетки экспрессируются в культуре, что указывает на роль в посредничестве взаимодействий, регулирующих поддержание стволовых клеток и/или дифференцировку (Varnum-Finney et al.) [10].

Обычно считается, что стволовые клетки реагируют на сигналы окружающей среды, которые стимулируют клеточное деление как стволовых клеток, так и их мультипотентного потомства, клеток, усиливающих транзит. Было предложено использовать некоторые консервативные диффузионные контрольные молекулы для регуляции самообновления стволовых клеток. Дробление нервных стволовых клеток in vitro можно стимулировать EGF и FGF. Резцы были тщательно иссечены с нижних челюстей (Мандибул) 2-дневных мышей (CBA × ЯМРТ). Этот этап был выбран для экспериментов, потому что на нем было легко отделять резцы от кальцинированной кости нижней челюсти. Апикальные концы резцов препарировали и культивировали в культурах органов типа совка с размером пор 0,1 Мкм.

Фильтры Nuclepore поддерживаются металлическими сетками в увлажненной атмосфере с содержанием 5 % CO ₂ в воздухе при 37 °C. Культуральная среда состояла из DME (GIBCO BRL) с добавлением 10 % FCS (GIBCO BRL), пенициллина/стрептомицина, глутамата I (GIBCO BRL) и 100 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma Chemical Co). Кальцификацию матриц эмали и дентина визуализировали с помощью окрашивания ализариновым красным. В экспериментах по рекомбинации тканей апикальные концы резцов инкубировали в течение 10 минут в 2 %-й коллагеназе (GIBCO BRL) в DME при 37 °C, а эпителий механически отделяли от мезенхимы в PBS. Эпителий помещали в контакт с мезенхимой и культивировали в течение 24 часов на фильтрах, как описано выше. Акриловые шарики с гепарином, высвобождающие FGF-10 (25 нг/мкл; Amgen), помещали в культуры целых апикальных концов резцов и на изолированную эпителиальную ткань. Контрольные гранулы инкубировали в BSA (Sigma Chemical Co) [11].

В заключение можно отметить, что уже существует метод построения зубов из собственных клеток пациента. Согласно последним исследованиям, возможно вырастить новые зубы для людей, используя их собственные клетки, и, вероятно, разработка недостающих аспектов этого метода ― лишь вопрос времени. Однако вопрос, насколько такой метод будет применим в стоматологических клиниках в будущем, остается открытым. Технически этот метод (по крайней мере, на данный момент) сложен, требует решения ряда проблем и устранения рисков. Одной из проблем является генетическое программирование зубных клеток из стволовых клеток, а также медленная скорость развития зубов. В естественных условиях формирование зуба занимает длительное время ― от года до нескольких лет у детей. Возможно, эту проблему можно было бы решить с помощью сигнальных молекул, стимулирующих рост.

Другие проблемы включают контроль формы, размера и цвета коронки зуба, но их можно решить существующими методами клинической стоматологии. Наконец, существует серьезный риск трансформации клеток, выращенных вне человеческого тела, в раковые клетки. Этот риск присутствует при большинстве методов лечения стволовыми клетками, и в настоящее время проводятся исследования, направленные на снижение этого риска.

Литература:

1. Thesleff I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 2018 Oct;126 Suppl 1:67–71. doi: 10.1111/eos.12421. PMID: 30178557.
2. Thesleff I., Tummers M. Stem cells and tissue engineering: prospects for regenerating tissues in dental practice. Med Princ Pract. 2003;12 Suppl 1:43–50. doi: 10.1159/000069840. PMID: 12707500.
3. Daltoé F. P., Mendonça P. P., Mantesso A., Deboni M. C. Can SHED or DPSCs be used to repair/regenerate non-dental tissues? A systematic review of in vivo studies. Braz Oral Res. 2014;28:S1806–83242014000100401. doi: 10.1590/1807–3107bor-2014.vol28.0037. Epub 2014 Aug 21. PMID: 25166769.
4. Yokohama-Tamaki T., Ohshima H., Fujiwara N., Takada Y., Ichimori Y., Wakisaka S., Ohuchi H., Harada H.. Cessation of Fgf10 signaling, resulting in a defective dental epithelial stem cell compartment, leads to the transition from crown to root formation. Development. 2006 Apr;133(7):1359–66. doi: 10.1242/dev.02307. Epub 2006 Mar 1. PMID: 16510502.
5. Kim M., Cooper D. D., Hayes S. F., Spangrude G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 1998 Jun 1;91(11):4106-17. PMID: 9596656.
6. Münzberg H., Morrison C. D. Structure, production and signaling of leptin. Metabolism. 2015 Jan;64(1):13-23. doi: 10.1016/j.metabol.2014.09.010. Epub 2014 Sep 28. PMID: 25305050; PMCID: PMC4267896.
7. Egan P., Drain S., Conway C., Bjourson A. J., Alexander H. D. Towards Stratified Medicine in Plasma Cell Myeloma. Int J Mol Sci. 2016 Oct 21;17(10):1760. doi: 10.3390/ijms17101760. PMID: 27775669; PMCID: PMC5085784.
8. Fortini M. E., Artavanis-Tsakonas S. Notch: neurogenesis is only part of the picture. Cell. 1993 Dec 31;75(7):1245-7. doi: 10.1016/0092-8674(93)90611-s. PMID: 8269507.
9. Maiden M. C., Jansen van Rensburg M. J., Bray J. E., Earle S. G., Ford S. A., Jolley K. A., McCarthy N. D. MLST revisited: the gene-by-gene approach to bacterial genomics. Nat Rev Microbiol. 2013 Oct;11(10):728-36. doi: 10.1038/nrmicro3093. Epub 2013 Sep 2. PMID: 23979428; PMCID: PMC3980634.
10. Ohishi K., Katayama N., Shiku H., Varnum-Finney B., Bernstein I. D. Notch signalling in hematopoiesis. Semin Cell Dev Biol. 2003 Apr;14(2):143-50. doi: 10.1016/s1084-9521(02)00183-0. PMID: 12651098.
11. Zhang S., Wu Y., Zhang Z., Luo Z., Zhao Y., Li Z., Chang Y., Yang J., Wu G., Zhang W., Yu S., Yuan K., Yang X. Photodissociation dynamics of CO ₂ + hv → CO(X1Σ+) + O(1D2) via the 3P1Πu state. J Chem Phys. 2022 Feb 7;156(5):054302. doi: 10.1063/5.0081489. PMID: 35135268.
12. Baranova J., Büchner D., Götz W., Schulze M., Tobiasch E.. Tooth Formation: Are the Hardest Tissues of Human Body Hard to Regenerate? Int J Mol Sci. 2020 Jun 4;21(11):4031. doi: 10.3390/ijms21114031. PMID: 32512908; PMCID: PMC7312198.
13. Morsczeck C., Reichert T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert Opin Biol Ther. 2018 Feb;18(2):187–196. doi: 10.1080/14712598.2018.1402004. Epub 2017 Nov 15. PMID: 29110535.
14. Nakashima M., Iohara K., Murakami M., Nakamura H., Sato Y., Ariji Y., Matsushita K. Pulp regeneration by transplantation of dental pulp stem cells in pulpitis: a pilot clinical study. Stem Cell Res Ther. 2017 Mar 9;8(1):61. doi: 10.1186/s13287–017–0506–5. PMID: 28279187; PMCID: PMC5345141.
15. Nakashima M., Iohara K., Zayed M. Pulp Regeneration: Current Approaches, Challenges, and Novel Rejuvenating Strategies for an Aging Population. J Endod. 2020 Sep;46(9S):S135-S142. doi: 10.1016/j.joen.2020.06.028. PMID: 32950185.
16. Alnasser M., Alshammari A. H., Siddiqui A. Y., Alothmani O. S., Issrani R., Iqbal A., Khattak O., Prabhu N. Tissue Regeneration on Rise: Dental Hard Tissue Regeneration and Challenges-A Narrative Review. Scientifica (Cairo). 2024 Apr 22;2024:9990562. doi: 10.1155/2024/9990562. PMID: 38690100; PMCID: PMC11057954.
17. Tatullo M., Codispoti B., Sied J., Makeeva I., Paduano F., Marrelli M., Spagnuolo G. Stem Cells-based and Molecular-based Approaches in Regenerative Dentistry: A Topical Review. Curr Stem Cell Res Ther. 2019;14 (7):607–616. doi: 10.2174/1574888X14666190626111154. PMID: 31271121.
18. Krivanek J., Soldatov R. A., Kastriti M. E., Chontorotzea T., Herdina A. N., Petersen J., Szarowska B., Landova M., Matejova V. K., Holla L. I., Kuchler U., Zdrilic I. V., Vijaykumar A., Balic A., Marangoni P., Klein O. D., Neves V. C. M., Yianni V., Sharpe P. T., Harkany T., Metscher B. D., Bajénoff M., Mina M., Fried K., Kharchenko P. V., Adameyko I. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nat Commun. 2020 Sep 23;11(1):4816. doi: 10.1038/s41467–020–18512–7. PMID: 32968047; PMCID: PMC7511944.
19. Fujiwara N., Akimoto T., Otsu K., Kagiya T., Ishizeki K., Harada H. Reduction of Egf signaling decides transition from crown to root in the development of mouse molars. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2009 Jul 15;312B(5):486–94. doi: 10.1002/jez.b.21268. PMID: 19090534.
20. Eldeeb D., Ikeda Y., Hojo H., Ohba S. Unraveling the hidden complexity: Exploring dental tissues through single-cell transcriptional profiling. Regen Ther. 2024 Apr 2;27:218–229. doi: 10.1016/j.reth.2024.03.023. PMID: 38596822; PMCID: PMC11002530.
21. Botelho J., Cavacas M. A., Machado V., Mendes J. J. Dental stem cells: recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Ann Med. 2017 Dec;49(8):644–651. doi: 10.1080/07853890.2017.1347705. Epub 2017 Jul 12. PMID: 28649865.
22. Liu J., Yu F., Sun Y., Jiang B., Zhang W., Yang J., Xu G. T., Liang A., Liu S. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2015 Mar;33(3):627–38. doi: 10.1002/stem.1909. PMID: 25447379.