Разработка методики, количественно выявляющей использование вещества «азодикарбонамид» в хлебопекарном производстве



В статье даётся характеристика азодикарбонамида, используемого в ряде стран в качестве хлебопекарной добавки. Рассматривается влияние азодикарбонамида и его производных, в частности, важнейшего производного семикарбазида, на показатели здоровья. Описаны официальный статус азодикарбонамида как пищевой добавки и практика его применения в мировой и отечественной хлебопекарной промышленности. Также в статье описывается разработанная в лаборатории доклинических исследований МФТИ методика, позволяющая выявить присутствие этого вещества в готовом хлебе и определить его концентрацию. Методика включает пробоподготовку и количественный анализ. В статье показано, что разработанная методика селективна, рабочий диапазон её применения релевантен мировой практике хлебопечения, калибровочная зависимость линейна. Методика может быть применена для количественного определения азодикарбонамида в хлебобулочных изделиях.

Ключевые слова: азодикарбонамид, семикарбазид, хлебопекарные добавки, высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия.

В пищевой промышленности широко используются различные добавки. Общим для них является то, что они не употребляются в пищу отдельно от продуктов питания.

Многие из пищевых добавок имеют собственный номер в системе нумерации Евросоюза по Codex Alimentarius, начинающийся с буквы E, но не все — например, ванилин номера не имеет.

История использования пищевых добавок восходит к применению в кулинарии поваренной соли. С появлением массового производства пищи список добавок существенно расширился. В ряде случаев отдалённые эффекты применения той или иной пищевой добавки выяснялись только после того, как оно приобретало массовый характер.

Сейчас применение пищевых добавок на территории Российской Федерации регулируется рядом федеральных законов, а также СанПиН 2.3.2.1293–03 [1] с дополнениями и изменениями, изложенными в СанПиН 2.3.2.2364–08 [2]. В приложениях 1 и 2 к первому указанному СанПиН дан список разрешённых на территории РФ пищевых добавок; в тексте второго из указанных СанПиН даны изменения списка. С целью запрещения какой-либо пищевой добавки выпускается специальное постановление Минздрава России.

Существуют добавки, имеющие промежуточный статус, так называемые не разрешённые — они не входят в список разрешённых, но и не запрещены постановлением Минздрава; статус означает, что в настоящий момент данная добавка проходит проверку.

Список пищевых добавок, входящих в состав продукта, должен быть указан на его потребительской упаковке — таково требование действующего Технического Регламента Таможенного Союза 022/2011 [3]. Однако некоторые продукты упаковываются только в транспортную упаковку — например, хлеб. ТР ТС 022/2011 предписывает указывать сведения о составе такого продукта на транспортной упаковке, но не говорит, как довести эти сведения до потребителя. При этом потребитель может не знать, что приобретённый им продукт содержит не разрешённые добавки.

Азодикарбонамид, являющийся предметом данной статьи, используется как хлебопекарная добавка. Вещество значилось в Приложении 1 к СанПиН 2.3.2.1293–03 как разрешённая добавка, однако СанПиН 2.3.2.2364–08 исключил его из списка разрешённых. Таким образом, азодикарбонамид попадает в категорию пищевых добавок, для обнаружения которых в пищевом продукте нужны и важны специальные усилия. Поэтому разработка методики, позволяющей установить наличие и определить концентрацию данного вещества в хлебопекарной продукции, представляется актуальной.

Азодикарбонамид (ADI в англоязычной традиции, АДА в русскоязычной) — это химическое вещество с брутто-формулой C₂H₄N₄O₂, упрощённая структурная формула NH₂CON=NCONH₂. Представляет собой жёлтый кристаллический порошок, не растворимый в воде. При нагревании до 215°C бурно разлагается с выделением большого объёма газа (реакция экзотермическая и автокаталитическая), но медленное самопроизвольное разложение идёт уже при температуре от 50°C. Разложение происходит по сложной схеме, основные газообразные продукты — азот и угарный газ.

В связи с этим АДА применяется как вспенивающий агент для ПВХ, полиэтилена, каучуков, используется для улучшения порообразования при изготовлении синтетической кожи, пенопластов и т. п.

АДА также используется в пищевом производстве как улучшитель качества муки и хлеба, зарегистрированный под номером Е927а. Будучи активным окислителем, АДА выступает в качестве отбеливателя зерновой муки. При его добавлении в муку наблюдаются стабилизация качества при поточном производстве, увеличение эластичности теста, его ускоренное созревание, воздушность и пористость мякиша, более длительная сохранность хлеба свежим.

Азодикарбонамид вступает в реакцию с тиоловыми группами глютена, окисляя их и формируя дисульфидные связи, как только начинает происходить увлажнение муки — именно тогда он проявляет свою повышенную активность при приготовлении теста [4]. Окисляя тиоловые группы, сам азодикарбонамид восстанавливается. Основным продуктом восстановления АДА является димочевина (брутто-формула C₂H₆N₄O₂, упрощённая структурная формула NH_2-CO-HN-NH-CO-NH₂), которая из-за нестабильности при нагревании в процессе выпекания хлеба разлагается до семикарбазида (SEM, брутто-формула CH₅N₂O, упрощённая структурная формула NH₂-NH-CO-NH₂) [5].

АДА относительно безвреден для организма, может вызывать аллергические реакции, в то время как SEM может значительно повлиять на здоровье человека: он обладает канцерогенными, мутагенными и тератогенными свойствами [6]. Поэтому АДА был исключен из списка разрешённых пищевых добавок в СанПиН 2.3.2.2364–08. Таким образом, чтобы предупредить и защитить потребителя от нежелательного токсического воздействия, необходим точный и чувствительный инструмент, способный за короткое время определить, использовался ли азодикарбонамид при производстве хлебобулочных изделий, содержится ли семикарбазид в продукции, и если да, то в каком количестве. Целью нашей работы была разработка такого инструмента.

1 Литературный обзор

1.1 Семикарбазид впродуктах питания

Семикарбазид (СЕМ) — вещество, загрязняющее различную пищевую продукцию, обладающее канцерогенными, мутагенными и тератогенными свойствами. Существует ряд путей его попадания в пищу: в результате разложения нитрофурала, используемого как антибиотик в животноводстве, из вспененных упаковочных материалов, а также рассматриваемый в нашей работе. Недавние исследования показали, что СЕМ образуется в хлебобулочных изделиях, выпеченных из муки с добавлением АДА [7].

Рис. 1. Формирование дисульфидных связей (источник [7])

В процессе производства хлеба АДА переходит в СЕМ в результате следующих химических реакций. Тиоловые группы (-SH) аминокислот (цистеинов), содержащихся в белках муки, окисляются АДА и формируют друг с другом дисульфидные связи, обеспечивающие прочный каркас клейковинных белков (рисунок 1). Эта реакция улучшает физические свойства теста. АДА не реакционноспособен в сухой муке, он проявляет свои окислительные свойства при добавлении воды. В ходе реакции АДА восстанавливается до димочевины, которая неустойчива и разлагается при нагревании. Одним из продуктов реакции разложения димочевины является семикарбазид [7] (рисунок 2).

Рис. 2. Реакции превращения АДА в СЕМ в процессе хлебного производства (источник [7])

1.2 Воздействие на здоровье

1.2.1 Азодикарбонамид

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает азодикарбонамид умеренно опасным для здоровья и указывает на то, что он вызывает болезни легких, астму и ряд аллергических заболеваний. АДА может вызывать аллергическую реакцию у тех, кто чувствителен к азосоединениям. Потребление АДА также может повысить аллергическую реакцию к другим ингредиентам пищи. Наиболее сообщаемыми эффектами негативного воздействия АДА на организм являются симптомы респираторных заболеваний, а также, в меньшей степени, повышение чувствительности кожи. В одном из отчетов описывается исследование двух лиц, работавших на одной и той же фабрике пластмассы 4 года. Оба с перерывами (1–2 недели, 3–4 раза в год) подвергались воздействию азодикарбонамида на работе. Впоследствии у обоих появились симптомы, описанные как «раздражение глаз / носа» на работе, позднее повлекших за собой астматические симптомы [8].

Отчетов, описывающих проявление других побочных эффектов в связи с воздействием АДА, не найдено.

1.2.2 Семикарбазид

СЕМ обладает умеренным канцерогенным потенциалом, способен вызывать генотоксические и другие токсические эффекты в сердечно-сосудистой и костной системах, может быть причиной нарушений в эмбриональном развитии. Ниже кратко описаны некоторые из экспериментов, исследовавших опасность СЕМ [9].

В исследовании Steffek et al. (1972) группам самок крыс по 3–11 особей перорально вводили СЕМ на 10–15 или 12–16 днях беременности в дозах 5/10/25/50/100 мг в день. При дозе 100 мг/день сдохло 3 из 9 подопытных животных. Затем крысы были убиты за день до срока беременности, а их плоды исследованы на наличие признаков жизни и расщелины нёба. В таблице 1 приведены результаты исследования.

Таблица 1

Результаты исследования эмбриональной токсичности семикарбазида (источник [9])

Доза СЕМ, мг вдень	5	10	25	50	100
Доля внутриутробных смертей	3 %	0 %	3 %	38 %	56 %
Доля плодов с расщелиной нёба (среди выживших)	0 %	0 %	43 %	95 %	100 %

В исследовании Mori et al. группу мышей, подвергшихся воздействию СЕМ, сравнивали с «чистыми» мышами. Тринадцать 6–8-недельных самок кормили пищей, содержащей 0,1 % СЕМ (приблизительно 150 мг / кг массы тела). Установлено, что животные набрали вес. После 7 месяцев на диете у 6 из 8 выживших (75 %) развилось 8 злокачественных легочных опухолей по сравнению с 1 опухолью у 1 из 20 (5 %) контрольных животных, не подвергавшихся воздействию СЕМ.

1.3 Использование Е927а вразных странах

В Евросоюзе и Австралии АДА признан высокотоксичным и запрещен не только к использованию в пищевой промышленности, но и к перевозке и хранению. За использование азодикарбонамида в Сингапуре грозит штраф в размере 450 тысяч долларов и тюремное заключение сроком до 15 лет.

В России широкое использование AДA в пищевой (прежде всего в хлебопекарной) индустрии наблюдалось вплоть до 2008 года. В 2008 году АДА был исключен из списка официально разрешенных добавок новой редакцией СанПиН (СанПиН 2.3.2. 2364 –08).

В США и Канаде многие крупные организации открыто признают использование АДА в своей продукции, хотя в Европе они прекратили это. Максимально разрешенное количество добавления АДА в муку составляет 45 мг/кг [10].

Использование АДА в качестве пищевой добавки вызывает волнение среди всего населения планеты. Многие переходят на правильное питание, покупая хлеб в «здоровых», по их мнению, заведениях. Но и это может быть опасно. В США, например, в булочках “Subway” был обнаружен СЕМ, хотя многие спортсмены и политики говорили о высоком качестве и полезных свойствах продукции. АДА не используется отделениями «Subway» ни в Европейском союзе, ни в Австралии, но в то же время он входит в состав сэндвичей «Subway», самых популярных в США. Из-за этого в 2014 году была создана петиция, адресованная главному исполнительному директору компании, для сбора подписей против использования Е927а в производстве [11].

1.4 Методика количественного определения азодикарбонамида вхлебе

1.4.1 Общие положения

Анализ сложных биологических смесей сводится к двум принципиально разным этапам. На первом образец готовится к анализу. Пробоподготовка обеспечивает экстракцию целевого вещества в раствор, позволяет избавиться от нежелательных компонентов исследуемого образца, которые могут негативно повлиять на оборудование и результат анализа. Кроме того, пробоподготовка нацелена на «подстройку» исследуемых веществ к прибору для получения достоверных результатов. На втором этапе образец непосредственно анализируется с помощью различных физических, химических, биологических техник, подобранных под исследуемое вещество.

На сегодня опубликовано несколько научных работ, посвященных исследованию роли АДА в процессе хлебопроизводства, изучению продуктов его разложения [6], [12], [13]. Также есть статья, посвящённая разработке методики обнаружения СЕМ в различных продуктах питания [7]. Наша методика разрабатывалась, основываясь на результатах, описанных в указанных работах, с учетом инструментальных возможностей лаборатории доклинических исследований МФТИ.

1.4.2 Пробоподготовка

Обыкновенно выбор правильной пробоподготовки и ее осуществление занимают большую часть времени разработки метода и непосредственно влияют на результат анализа. Ниже перечислены основные этапы подготовки образца к анализу, используемые в данной работе.

а) Гомогенизация (измельчение)

При работе с неоднородными образцами перед экстракцией искомого вещества необходимо привести образец к однородному виду, т. е. гомогенизировать. В нашей работе этот этап реализуется с помощью диспергирования навески хлеба с добавлением воды до получения однородной суспензии (рисунок 3).

Рис. 3. Диспергирование водно-хлебной смеси (составлено автором)

б) Экстракция

Необходимо найти способ извлечения искомого вещества из образца с помощью подходящего растворителя. В случае, когда экстракция проводится на основании различного распределения вещества между двумя (или более) несмешивающимися жидкостями, она называется жидкость-жидкостной (ЖЖ). В нашей работе СЕМ сначала экстрагируется из сухого хлеба с помощью воды, а затем из первичного экстракта с помощью несмешиваемого с водой этилацетата. Таким образом проба очищается от нежелательных примесей, также экстрагированных из хлеба водой (рисунок 4).

Рис. 4. ЖЖ экстракция этилацетатом (составлено автором)

в) Дериватизация

Данный этап «подстраивает» исследуемое вещество к прибору, преобразуя его химическую структуру. Анализируемое соединение участвует в реакции дериватизации и превращается в производное вещество (дериват) с отличающимися от изначального вещества физико-химическими свойствами, которые способствуют более эффективному и точному детектированию исследуемого компонента в образцах. В нашей работе в раствор СЕМ добавляют нитробензальдегид, что приводит к химической реакции (реакция дериватизации, рисунок 5), продуктом которой является вещество НФ-СЕМ, более удобное для детектирования (рисунок 6).

Рис. 5. Процесс дериватизации после добавления нитробензальдегида (составлено автором)

Рис. 6. Реакция дериватизации семикарбазида (составлено автором)

г)Концентрирование

На этом этапе исследуемый компонент переводят из большого объёма растворителя в малый, увеличивая таким образом его концентрацию, что повышает чувствительность метода и понижает нижний предел детектирования вещества. В нашей работе для этого используется испаритель в токе азота, выпаривающий этилацетатный экстракт (рисунок 7), отобранный после ЖЖ экстракции, с последующим перерастворением высушенного образца в меньшем объеме растворителя.

Рис. 7. Выпаривание образцов (составлено автором)

1.4.3 Анализ приготовленного образца

В большинстве научных работ, посвящённых исследованию СЕМ в продуктах питания, для его количественного анализа используют технику ВЭЖХ-МС/МС, которая сочетает в себе разделение сложных химических смесей при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и определение молекулярной массы детектируемых частиц при помощи тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). Широкое распространение этой методики вызвано рядом преимуществ, среди которых:

– высокая чувствительность обнаружения веществ;

– высокая скорость анализа;

– воспроизводимость измерений, высокая точность.

Принципиальная схема ВЭЖХ-МС/МС отображена на рисунке 8. Аналитическая смесь, разделяясь на хроматографической колонке, поступает на МС/МС детектор. Реализация принципиальной схемы в лаборатории доклинических исследований МФТИ представлена на рисунке 9. Кратко рассмотрим принципы действия основных элементов прибора.

Рис. 8. Принципиальная схема ВЭЖХ-МС/МС (составлено автором)

В ВЭЖХ исследуемый образец, введённый через инжектор, при помощи жидкости под большим давлением проходит через колонку, покрытую изнутри неподвижной фазой. Разделение на компоненты исследуемого образца, представляющего собой сложную химическую смесь, осуществляется за счет различной силы взаимодействия компонентов с неподвижной фазой.

Масс-спектрометрия (MS) — это аналитическая техника, которая позволяет измерять отношение массы ионов к их заряду. Работа масс-спектрометра основана на ионизации химических веществ, генерации их потока в ионную оптику, измерения отношения их массы к заряду. Таким образом, масс-спектрометр состоит из трех модулей: ионный источник, который может переводить исходные молекулы в ионы, масс-анализатор, который сортирует ионы согласно их массам, и детектор, позволяющий «поймать» отсортированные частицы и сформировать сигнал (отклик детектора).

Рис.9. ВЭЖХ-МС/МС в лаборатории доклинических исследований МФТИ (составлено автором)

1.4.4 Количественный анализ

Чтобы произвести количественный анализ исследуемого вещества в готовой пробе, необходимо откалибровать прибор. Для этого готовятся так называемые стандартные растворы (разведения) исследуемого вещества (рисунок 10) в известных концентрациях в водном экстракте заведомо чистого хлеба (при выпекании которого не использовался АДА). Данные растворы имитируют водные экстракты опытных хлебных образцов, однако, в отличие от них, здесь мы заведомо знаем реальную концентрацию СЕМ в каждом стандартном растворе. Затем стандартные растворы вместе с экстрактами исследуемых образцов подвергаются дальнейшей пробоподготовке. Пробы, приготовленные из стандартных растворов, называют калибровочными. Их отправляют на анализ и для каждой точки получают данные с детектора. Интенсивность сигнала детектора, относящегося к обнаружению СЕМ, прямо пропорциональна количеству СЕМ в стандартном растворе. Таким образом, за счет соотношения сигнала СЕМ с реальным значением концентрации во всех калибровочных пробах строится линейная калибровочная зависимость. При обнаружении в экстракте опытного образца сигнала СЕМ, его количественное содержание определяется на основании построенной калибровки.

Рис. 10. Стандартные растворы СЕМ (составлено автором)

1.5 Основные характеристики методики

Существует ряд характеристик методики, описывающих приемлемость и достоверность получаемых с её помощью аналитических данных. Рассмотрим некоторые из них, определяемые в данной работе.

Селективность (специфичность) метода — способность однозначно определять исследуемое вещество в сложной смеси независимо от остальных её компонентов. Это означает, что отклик на определяемое соединение (СЕМ) в чистой пробе (экстракте заведомо чистого хлеба) должен отсутствовать, либо быть на уровне шума. Напротив, хорошо детектируемый пик СЕМ должен присутствовать при анализе калибровочных проб.

Нижний предел количественного обнаружения (НПКО) — это минимальная концентрация СЕМ в стандартных растворах в том случае, если выполняются следующие условия:

– отклик СЕМ на уровне НПКО должен как минимум в 5 раз превышать отклик сигнала в экстракте заведомо чистого хлеба (условие сигнал/шум> 5);

– сигнал вещества на хроматограмме должен быть четким, правильной формы;

– при многократном анализе пробы, содержащей СЕМ на уровне НПКО, интенсивность сигнала должна быть хорошо воспроизводима.

Калибровочный диапазон (рабочий диапазон концентраций) методики — это диапазон, начинающийся с концентрации исследуемого вещества на уровне НПКО и заканчивающийся концентрацией, выше которой интенсивность сигнала СЕМ перестает быть прямо пропорциональной его количеству в образце (область насыщения). В рабочем диапазоне концентраций готовят 4–7 стандартных растворов, их подвергают пробоподготовке и анализируют для построения калибровочной прямой.

Линейность калибровочной зависимости — это характеристика аппроксимации калибровочных точек. Калибровочная зависимость строится соотношением сигналов СЕМ с номинальными значениями его концентраций в калибровочных пробах. Решается математическая задача по поиску линейной зависимости y=k*x+b, проходящей максимально близко к каждому наблюдению (каждой калибровочной точке). В случае, если поведение калибровочных точек хаотично, они слишком сильно разбросаны и их поведение не может быть описано линейной зависимостью, методика считается непригодной к использованию.

2 Экспериментальная часть

2.1 Материалы, реактивы иоборудование

2.1.1 Стандартные вещества

Для разработки и оптимизации параметров метода анализа исследуемого вещества, а также приготовления калибровочных стандартных растворов использовали сток-раствор СЕМ в H₂O с концентрацией 1 мг/мл, полученный от АНО «Роскачество».

Для исследования процесса образования СЕМ при выпекании хлеба использовали АДА, приобретенный у компании Prime Chemicals Group, с заявленной чистотой не менее 99,0 %.

2.1.2 Химические реактивы

В ходе исследования применялись следующие реактивы:

– деионизированная вода;

– нитробензальдегид х/ч;

– метанол OPTIMA LC/MS Grade, 99,99 %, Fisher Chemical, США;

– этилацетат хч, rushim.ru;

– ацетонитрил OPTIMA LC/MS Grade, >99.9 %, Fisher Chemical, США;

– муравьиная кислота, >99.5 %, OPTIMA LC/MS Grade, США;

– натрия гирдофосфат дигидрат, 99 %, Acros organics, США;

– натрия дигидрофосфат дигидрат, 99+ %, Acros organics, США;

– 85 % раствор фосфорной кислоты, Acros organics, США.

2.1.3 Материалы

В ходе исследования были использованы следующие материалы:

– лабораторные перчатки;

– полипропиленовые пробирки типа эппендорф 5 мл;

– фальконы на 15 мл (Eppendorf);

– фальконы на 50 мл (Eppendorf);

– наконечники для пиппеток 200 мкл, 1мл, 5мл;

– Hybrid SPE-PPT 96-луночная плашка.

2.1.4 Оборудование

Работа производилась на следующем оборудовании:

– ВЭЖХ система Shimadzu (Shimadzu Corp.);

– тандемный масс-спектрометр QTRAP 6500 (AB SciexCorp);

– весы лабораторные электронные OHAUS Discovery;

– смеситель лабораторный IKA MS3 basic Vortex;

– смеситель лабораторный Genie-2 Vortex;

– диспергатор IKA T25 digital ULTRA TURRAX;

– центрифуга Eppendorf 5810R;

– рН — метр HI2212 Hanna Instruments;

– ультразвуковая баня Elmasonic S 40H;

– эвапоратор VLM EVA (Organomation Associates, Inc.);

– очистка воды Satorius stedim arium 61316, Satoriu sstedim arium pro VF;

– магнитная мешалка IKA RCT Basic;

– мерные цилиндры 10,50 мл;

– автоматические дозаторы Transferpette;

– автоматическая хлебопечка Panasonic SD-2501/SD-2500.

– термостат для хроматографической колонки CTO-20AC prominence.

Тандемный масс-спектрометр QTRAP 6500 (AB SciexCorp) используется с программным обеспечением Analyst 1.6.3. (AB SciexCorp.).

2.2 Выпекание хлеба

В целях нашего исследования мы собственноручно выпекали три батона из пшеничной муки: один — без добавления АДА, второй и третий — с добавлением АДА в муку в различных количествах. Хлеб без АДА пекли, чтобы убедиться в селективности метода, а также чтобы получить водный экстракт чистого хлеба для приготовления стандартных растворов СЕМ. Хлеб с АДА пекли, чтобы доказать связь между использованием пищевой добавки и наличием СЕМ в готовом продукте, а также чтобы исследовать зависимость расхода АДА в муку и количества СЕМ в испеченном хлебе. Каждый батон пекли в максимально единообразных условиях следующим образом:

Брали 400±5 г пшеничной муки и тщательно перемешивали с 63,8 мг АДА в одном случае и с 31,5 мг в другом при помощи кофемолки, либо не добавляли АДА вообще. Затем добавляли 5 г дрожжей, а также 13 г сахара, 5 г соли, 9 г растительного масла и 250±5 мл воды. Затем перемешивали ингредиенты и пекли хлеб в автоматической хлебопечке суммарно в течение трех часов, согласно одной из стандартных программ: 40 мин — выравнивание температуры, 20 — мин замес теста, 1 час — подъем, 1 час выпечка. Вес хлеба после замешивания и до выпекания составлял 690±10 г. После выпекания он весил около 590±10 г.

2.3 Приготовление растворов

2.3.1 Приготовление стандартных калибровочных растворов СЕМ

Для приготовления стандартных калибровочных растворов СЕМ использовали сток-раствор СЕМ с концентрацией 1 мг/мл (106 нг/мл СЕМ в H2O) и, используя пластиковые фальконы на 50 мл, разводили его в водном экстракте «чистого» хлеба (способ приготовления раствора-разбавителя описан в пункте 2.4) до получения семи растворов с концентрациями 500; 100; 50; 10; 5; 1; 0.5 нг/мл. Схема разведений приведена на рисунке 11.

Рис. 11. Разведение стандартных калибровочных растворов (составлено автором)

2.3.2 Приготовление раствора нитробензальдегида (НБА)

Для приготовления раствора нитробензальдегида с концентрацией 3 мг/мл около 42 мг (точная навеска) НБА растворяли в 14 мл метанола в фальконе объемом 15 мл. Смесь перемешивали на вортексе до полного растворения.

2.3.3 Приготовление фосфатного буфера

Для приготовления фосфатного буфера 1,24 г дигидрофосфата натрия растворяли в 990мл деионизированной воды, затем 34,17 г гидрофосфата натрия растворяли в 990 мл деионизированной воды. Оба раствора перемешивали на магнитной мешалке до полного растворения солей. Затем растворы смешивали в мерном цилиндре на 2 л, доводили pH до значения 3,5 добавлением концентрированной фосфорной кислоты (контроль pH-метром). Полученный раствор доводили деионизированной водой до метки 2 л и переливали в стеклянную бутыль.

2.4 Пробоподготовка

2.4.1 Экстракция СЕМ из хлеба водой

Хлеб разделывали на доске для резки. Затем шпателем отбирали 7г мякиша в фалькон на 50 мл (7г отмеряли на весах) и добавляли 28 мл деионизированной H₂O (разбавляли навеску хлеба по массе в 5 раз). После полученную смесь диспергировали в течение 2–3 минут на скорости 15000 об/мин. Затем фалькон помещали в ультразвуковую баню на 15 минут при температуре 50°С для перемешивания и более полного экстрагирования, после чего фалькон центрифугировали 15 минут при 4000 об/мин при комнатной температуре 23°С, тщательно проверяя равновесие перед запуском центрифуги. Из центрифугированного образца в фалькон на 50 мл отбирали надосадочную жидкость (экстракт).

Раствор-разбавитель, используемый для приготовления стандартных растворов, получали экстрагированием батона белого хлеба, испеченного без добавления АДА.

2.4.2 Дериватизация, ЖЖ экстракция, концентрирование

В фалькон на 50 мл добавляли 10 мл водного экстракта опытного образца (либо, в случае калибровочных проб, стандартного раствора), 10 мл фосфатного буфера и 200 мкл раствора НБА. Затем фалькон перемешивали на вортексе в течение 30 секунд и оставляли в термостате на 1 час при температуре 37°С. Далее добавляли 10 мл этилацетата и тщательно перемешивали на вортексе в течение 2 минут, после чего образец погружали в ультразвуковую баню на 5 минут при комнатной температуре. Затем фалькон центрифугировали 15 минут при 4000 об/мин при температуре 4°С. Далее отбирали 3 мл верхней фракции (этилацетатной) в пробирку на 5 мл и выпаривали её досуха на эвапораторе. Полученные сухие остатки перерастворяли в смеси ацетонитрил:вода (1:1) и отправляли на анализ.

2.5 Хроматографические и масс-спектрометрические условия

Разработка и оптимизация условий поиска и детектирования исследуемого компонента (НФ-СЕМ) в приготовленных образцах с помощью технологии ВЭЖХ-МС/МС осуществлялась по принципу достижения максимальной чувствительности.

Хроматографическое разделение производили на колонке YMC-Triart C18, 50х2.0 мм, 3 мкм (YMC, Japan) cо встроенной предколонкой EXP filter holder (Optimize technologies, USA) при 35°С. Использовали градиентное элюирование (таблица 2): подвижной фазой A была вода, Б — ацетонитрил. В обе фазы добавляли 0.1 % муравьиной кислоты. Скорость подвижной фазы и объем закола были установлены 300 мкл/мин и 2 мкл соответственно.

Таблица 2

Градиентное элюирование (составлено автором, данные получены влаборатории доклинических исследований МФТИ)

Время, мин.	А,%	Б,%
0	95	5
0.5	5	95
2.2	5	95
2.3	95	5
3.4	95	5

В работе использовалась ионизация электроспреем (ESI) в позитивном режиме. Для определения НФ-СЕМ был разработан МС/МС метод с детектированием в режиме MRM (мониторинг заданных реакций) двух реакций на основе наиболее интенсивных переходов ион-предшественник — ион-продукт 209.0/166.0 (m/z) и 209.0/192.1 (m/z) для количественного анализа и верификации сигнала соответственно. Остальные параметры МС/МС детектирования представлены в таблице 3.

Таблица 3

Основные параметры МС/МС детектирования (составлено автором, данные получены влаборатории доклинических исследований МФТИ)

Параметр	Значение
	НФ-СЕМ209→166	НФ-СЕМ 209→192
Температура ионного источника, ˚C	500
Высокое напряжение в источнике, В	4500
Газовая завеса, литры/мин	35
Газ 1, литры/мин	50
Газ 2, литры/мин	50
Декластеризующий потенциал (DP), В	88
Потенциал на входе (EP), В	10
Энергия соударения (CE), В	14	17

3 Результаты ивыводы

3.1 Пригодность методики

3.1.1 Селективность

Рис. 12. Сигнал детектора при анализе пробы, приготовленной из чистого хлеба (составлено автором)

Селективность была продемонстрирована отсутствием сигнала семикарбазида в пробе, приготовленной из водного экстракта чистого хлеба (рисунок 12). Напротив, хорошо детектируемый пик НФ-СЕМ присутствовал во всех калибровочных пробах (рисунок 13).

Рис.13 Сигнал детектора при анализе пробы, приготовленной из стандартного раствора СЕМ с концентрацией 10 нг/мл (составлено автором)

3.1.2 Нижний предел количественного обнаружения

НПКО разработанной методики оказалась концентрация семикарбазида в водном экстракте на уровне 0.5 нг/мл. Для стандартного раствора именно с такой концентрацией отношение сигнала НФ-СЕМ в приготовленной пробе к шуму детектора было на уровне 5, сигнал был четким и правильной формы (рисунок 14).

Рис. 14. Сигнал детектора при анализе пробы, приготовленной из стандартного раствора СЕМ с концентрацией 0,5 нг/мл, соответствующей НПКО (составлено автором)

3.1.3 Рабочий диапазон и линейность калибровочной зависимости

За верхнюю границу рабочего диапазона был выбран стандартный раствор с концентарцией 500 нг/мл. Рабочим диапазоном нашей методики оказался промежуток концентраций СЕМ 0.5–500 нг/мл в водном экстракте. По результатам анализа семи проб, приготовленных из стандартных разведений СЕМ с концентрациями 0.5;1;5;10;50;100;500 нг/мл (рисунок 15), была построена калибровочная зависимость. Полученные точки с хорошей точностью ложились на прямую линию с уравнением y=122000x и коэффициентом корреляции r=0.9924, подтверждая пропорциональное увеличение сигнала СЕМ в зависимости от его концентрации в стандартном растворе, что доказывало пригодность разработанной методики.

Рис. 15. Калибровочная прямая, переводящая интенсивность сигнала детектора в единицы концентрации СЕМ в водном экстракте (составлено автором)

Разработанная методика физико-химического анализа оказалась, таким образом, селективной и высокочувствительной к семикарбазиду в образцах. Рабочий диапазон методики — от 0.5 до 500 нг/мл семикарбазида в водных экстрактах хлеба. Этот диапазон покрывает диапазон разрешённых концентраций азодикарбонамида в странах, в которых его использование в хлебопекарной промышленности разрешено, и является, таким образом, релевантным мировой практике хлебопечения.

3.2 Образование семикарбазида при выпекании хлеба

Рассмотрим результаты анализа проб, приготовленных из двух батонов, при выпекании которых использовался АДА. Было приготовлено по три независимых пробы с каждого батона и исследовано количественное содержание СЕМ в их водных экстрактах. Результаты представлены в таблице 4.

Результаты анализа подтвердили основную гипотезу исследования: при использовании пищевой добавки Е927а в хлебоперакрном производстве, в готовом продукте образуется токсическое вещество СЕМ. Более того, посчитанные по калибровочной прямой концентрации СЕМ в водных экстрактах загрязненных хлебов оказались прямо пропорциональны количествам АДА, добавленным в муку при их выпекании, как видно на рисунке 16. Процент от АДА, перешедший в экстрагированный в воду СЕМ, оказался на уровне 0,7 в обоих случаях.

Таблица 4

Исследование превращения АДА вСЕМ при хлебопекарном производстве (составлено автором, данные получены влаборатории доклинических исследований МФТИ)

Батон, №	Добавлено АДА, мг	Количество муки, кг	Масса испеченного хлеба, кг	Расход АДА на массу муки, мг/кг	Расход АДА на массу готового хлеба, мг/кг	Усредненная концентрация СЕМ вводном экстракте хлеба, нг/мл	Количество СЕМ впересчете на массу хлеба, нг/г	Количество СЕМ впересчете на массу хлеба, мг/кг	% АДА, перешедший вэкстрагированный вводу СЕМ
1	31.5	0.4	0.59	78.75	53.39	74.2	371	0.371	0.69%
2	63.8			159.5	108.13	156	780	0.78	0.72%

Рассчитаем, какое минимальное количество АДА, использованного в хлебопекарном производстве, можно выявить с помощью разработанной методики. Для этого построим зависимость количества СЕМ, обнаруженного в водном экстракте (нг/мл, 7й столбец таблицы 5), от расхода АДА на массу муки (мг/кг, 5й столбец таблицы 5). Результат — линейная зависимость y=0.971*x (рисунок 15). НПКО семикарбазида в водном экстракте составляет 0.5 нг/мл, данная концентрация соответствует использованию АДА в количестве 0.5 мг/кг муки.

Полученные результаты ещё раз показывают пригодность разработанной методики для достижения практических целей.

Рис. 16. График зависимости концентрации СЕМ от расхода АДА (составлено автором)

Литература:

1. СанПиН 2.3.2.1293–03 Гигиенические требования по применению пищевых добавок [Электронный ресурс]. URL: http://docs.cntd.ru/document/901862338 (дата просмотра: 15.02.2018)
2. СанПиН 2.3.2.2364–08 Гигиенические требования по применению пищевых добавок. Дополнения и изменения N 1 к СанПиН 2.3.2.1293–03 [Электронный ресурс]. URL: http://docs.cntd.ru/document/902106055 (дата просмотра: 15.02.2018)
3. Технический регламент Таможенного Союза 022/2011 Пищевая продукция в части ее маркировки [Электронный ресурс]. URL: http://webportalsrv.gost.ru/portal/GostNews.nsf/acaf7051ec840948c22571290059c78f/9fe752e7e38cc18e44257bde0024e7d4/$FILE/TR_TS_022–2011_text.pdf
4. E927a Азодикарбонамид [Электронный ресурс]. URL: http://ruslekar.info/E927a-Azodikarbonamid-1679.html (дата просмторта: 16.02.2018).
5. Азодикарбонамид — информация о продукте на портале CHEMINDUSTRY.RU [Электронный ресурс]. URL: http://chemindustry.ru/rus/chemicals/Azodicarbonamide.php (дата просмторта: 16.02.2018).
6. Ye J. et al. Assessment of the determination of azodicarbonamide and its decomposition product semicarbazide: Investigation of variation in flour and flour products // J. Agric. Food Chem. 2011. Vol. 59, № 17. P. 9313–9318.
7. Li G. et al. A Rapid and Sensitive Method for Semicarbazide Screening in Foodstuffs by HPLC with Fluorescence Detection // Food Anal. Methods. 2015. Vol. 8, № 7. P. 1804–1811.
8. Mr R. Cary, Dr S. Dobson, Mrs E. Ball. AZODICARBONAMIDE // World Health Organization Geneva. Geneva, 1999. 27 p.
9. EFSA. Opinion of the Scientific Panel on Food Additives, Flavourings, Processing Aids and Materials in Contact with Food on a request from the Commission related to Bisohenol A // Efsa J. 2006. Vol. 965. P. 1–7.
10. Nutrition C. for F. S. and A. Food Additives & Ingredients — Food Additive Status List [Электронный ресурс]. Center for Food Safety and Applied Nutrition. URL: https://www.fda.gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/FoodAdditivesIngredients/ucm091048.htm (дата просмторта: 21.02.2018).
11. Launching Subway Petition — They Will Finally Hear From Us, Loud and Clear [Электронный ресурс]. URL: https://foodbabe.com/launching-petition-subway-will-finally-hear-us-loud-clear/ (дата просмторта: 21.02.2018).
12. Noonan G. O., Begley T. H., Diachenko G. W. Semicarbazide formation in flour and bread // J. Agric. Food Chem. 2008. Vol. 56, № 6. P. 2064–2067.
13. Becalski A. et al. Semicarbazide Formation in Azodicarbonamide-Treated Flour: A Model Study // J. Agric. Food Chem. 2004. Vol. 52, № 18. P. 5730–5734.

---

[1] Авторы статьи выражают благодарность заведующему лабораторией доклинических исследований МФТИ Алексееву С.Г., Компании Лабтех, Антону Алашееву и Антону Анфиногентову; Автономной некоммерческой организации Роскачество; Викуловой Людмиле и Рябову Александру