Авторы: Мовсум-заде С.К., Мехтиев А.А.

Рубрика: Биология

Опубликовано в Молодой учёный №6 (17) июнь 2010 г.

Статья просмотрена: 20 раз

Библиографическое описание:

Мовсум-заде С., Мехтиев А. Индуцирование мутации рыб блокадой серотонин-модулируемого антиконсолида¬ционного белка антителами // Молодой ученый. — 2010. — №6. — С. 77-81. — URL https://moluch.ru/archive/17/1641/ (дата обращения: 16.12.2017).

The article concerns studies of effect of decreased activity of serotonergic system on the level of mutagenic changes (micronucleus test) in gobies (Neogobius fluviatilis) and sturgeon juveniles (Acipen­ser gueldenstaedti persicus). It is shown that prolonged exposure of animals to the industrial and oil pollution leads to signi­ficant decrease of the level of serotonin-modulating anticonsolidation protein (SMAP) being in linear relationship with the serotonin level, in the liver and, simul­taneously, to acute elevation of Micronuclei level in erythrocytes. Intramus­cular administration of ant-SMAP polyclonal antibodies to the sturgeon juveniles induces significant increase of micronuclei amount in erythrocytes relatively to the group of animals injected with non-immune γ-globulins. The results give grounds to make a conclusion that downregulation of serotonergic system activity presents the mechanism launched by adverse environmental factors and realizing mutagenic damages in the modified genetic apparatus.  

Key words: serotonin-modulating anticonsolidation protein (SMAP), mutagenic changes, industrial and oil pollution, polyclonal antibodies to SMAP.

Неблагоприятные факторы окружающей среды различной природы вы­зы­вают значи­тельное изменение активности серотонинергической сис­темы в тканях животных. В частности, повышенная солёность воды (1%-ный рас­т­вор NaCl) приводит к резкому увеличению уровня серотонина и дофамина в структурах головного мозга мальков карпа [1]. хроническая экспозиция рыб в воде, содержащей примеси меди [2] и ртути [3], приводит к зна­чи­тель­ному снижению уровня серотонина в тканях животных. В иссле­до­ва­ниях, прове­денных на ракообразных, было показано, что дли­тель­ная экс­по­зи­ция живот­ных в воде, содержащей примеси тяжёлых метал­лов и органи­чес­ких соеди­нений, оказывает негативное воздей­ст­вие на обмен серо­тонина, при­­­­­­­во­дя к сни­­жению его уровня [4]. Вместе с тем, большин­ство неблаго­при­ятных фак­торов обладают способностью индуцировать мутаген­ные изме­нения в тка­нях [5, 6]. В этой связи представляет несомненный интерес изу­чение роли серото­нинергической системы в развитии мутагенных измене­ний.

Материалы и методы исследований

Работа выполнена на бычках (Neogobius fluviatilis), обитающих в при­бреж­ной зоне Каспийского моря и ведущих осёдлый образ жизни, и на  моло­ди осетров (Acipenser gueldenstaedti persicus). Бычки (по 7 особей) были вы­лов­лены в двух зонах – в относительно чистой и в зоне, характери­зую­щейся высоким уровнем загрязнения железом, цинком и полиаромати­чес­кими углеводородами. У животных брали про­бы крови из хвостовой вены, делали мазки на предметных стёклах, окраши­вали по Рома­новскому-Гимзе и под световым микроскопом подсчи­ты­­вали количество микроядер в 2000 эрит­ро­цитов, пересчитывая полученное коли­чество на 1000 клеток. Одно­вре­мен­но у животных забирали пробы печени, экс­трагировали водорас­творимые белки и определяли содержа­ние серото­нин-мо­дулируемого анти­кон­солида­цион­ного белка (СМАБ) методом твёрдо­фаз­ного иммунофер­мен­т­ного анали­за на поли­стироловых планшетах. При про­ве­де­нии ана­ли­за в ка­честве ан­ти­генов ис­поль­­зовали сум­мар­ные белки печени осетров, экстраги­ро­ванные в 0,05 М фос­фатном буфере (рН 7,2-7,4), со­державшем 0,3 М NaCl, 5 мМ ЭДТА и 0,1%-ный тритон Х-100 и доведённые до концен­трации 20 мкг/мл с помо­щью 0,1 М буфера трис-HCl (pH 8,6). Каждую пробу дубли­ро­вали триж­ды и по завершении реакции вычисляли среднюю арифметическую из значений трёх проб. Кон­центрацию белка определяли по ме­то­ду Бредфорд с ис­поль­­­зо­вани­ем 0,01%-ного раст­вора Кумасси брил­ли­ан­то­вого синего G-250, на длине волны 595 нм [10]. в качестве пер­вых ан­ти­­тел ис­поль­зова­ли кроли­чьи им­му­но­гло­булины к белку СМАБ, а в ка­честве вто­рых анти­тел – проти­во­­кроличьи козьи имму­но­гло­бу­лины с ко­нъю­ги­ро­ванной пер­­­ок­си­дазой хре­на. Визуа­лиза­цию реа­к­ции осу­щес­твляли с по­мо­­щью суб­с­трата перок­сидазы хре­на – 0,05%­­­­ -ного рас­тво­ра ортофе­ни­лен­ди­амина в 0,05 М цитрат-фосфат­ном буфе­ре (pH 4,5). Реак­цию останав­лива­ли че­­рез 20 мин после добавления субстрата путем прили­ва­ния в лунки 3 М рас­твора NaOH, а резуль­таты реа­к­ции счи­тывали на фо­то­метре для им­му­но­­фер­мен­тного анализа “StatFax 303” (Aware­ness, США) на длине вол­ны 492 нм. Результаты исследования усред­няли по группам и срав­нивали по t–критерию Стьюдента.

Во второй серии экспериментов, выполненных на годо­валой молоди осетров, жи­вотных разбили на 3 группы: 1) группа интактных животных (n=7); 2) группа жи­вот­ных, находившихся в тече­ние 5 сут в пресной воде, со­дер­жав­шей нефть из месторождения «Неф­тяные кам­ни» в концентрации 100 мг/л (n=7); 3) группа животных, находившихся в те­че­­ние 15 сут в пре­сной воде, содер­жав­шей нефть в той же концентрации (n=7). По завер­шении экс­пе­­риментов у осетров брали пробы крови из хвостовой вены для про­ведения микро­ядер­ного теста, а так­же пробы печени для определения уровня СМАБ методом иммунофер­мен­тного анализа. Результаты исследования усред­няли по группам и срав­нивали по t–критерию Стьюдента.

В третьей серии исследования также осуществляли на молоди осетров ве­сом 10-15 г и были использованы 3 группы животных: 1) группа интактных жи­вотных (n=11); 2) группа животных (n=10), которым внутримы­шеч­но вво­дили кроличьи неиммунные γ-глобулины в концентрации 1,5 мг/мл и объёме 0,7 мл (в целях контроля неспецифических эффектов гетеро­логи­ческих анти­тел); 3) группа жи­вотных (n=9), которым вводили кроличьи поликло­нальные антитела к белку СМАБ в таком же количестве. Антитела к СМАБ очищали из раствора иммуноглобулинов, полученных в результате 5-6-месяч­ной им­му­­­ни­за­ции кроликов этим белком, методом аффинной хромато­графии на ко­лонке CNBr-сефарозы с предварительно иммобилизованным СМАБ. СМАБ вы­де­ляли в препаративных количествах из головного мозга быка описанным ранее способом [7]; гомогенность выделенного белка оцени­вали методом электрофореза в полиакриламидном геле в трис-глициновой буферной систе­ме (рН 8,3). Инъек­ции неиммунных γ-глобулинов и анти­тел молоди осетров осу­щес­твляли дважды: в 1-ый день и через 24 ч. На 3-ьи сут после первой инъекции у животных из хво­­­стовой вены забирали пробы крови для про­ве­дения микроядерного теста. Результаты исследования усред­няли по группам и срав­нивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

СМАБ был ранее идентифицирован в коре головного мозга и вы­де­лен из це­лого мозга крыс, оп­ре­де­лены его физико-химические свойства и участие в инте­г­ратив­ной дея­тель­но­сти нер­в­ных клеток, в частности, в процессе консо­лидации следов памяти  [7]. Биохи­мическими исследо­вани­я­ми, выполнен­ны­ми на коре голо­в­но­го мозга нарко­ти­зированных крыс [7, 8], и эл­ек­тро­фи­зио­ло­ги­чес­кими ис­сле­дова­ни­ями, связанными с регистрацией нейрональной ак­тив­ности на иден­ти­­фи­ци­рованных команд­ных нейро­нах моллю­сков [9], было показано, что со­дер­жа­ние СМАБ в нер­вных клетках жи­вот­ных нахо­дится в пря­мой зави­симости от уровня серо­тонина. Указанный факт поз­во­ляет оце­ни­вать внутриклеточную актив­ность се­ро­то­нин­­ерги­чес­кой сис­те­мы по уров­ню СМАБ в исследуемых тканях, а также целе­на­п­равленно воз­дей­ствовать на активность этой системы путём введения в организм самого бел­ка или анти­тел к нему.

В результате проведенных исследований на бычках было установлено, что в микроядерном тесте количество микроядер в эритроцитах рыб из за­гряз­нённой зоны значительно превышало их количество у животных из чис­той зоны (p<0,001; Рис.1А). При изучении содержания СМАБ в печени быч­ков было обнаружено его значительное снижение у животных, вылов­лен­ных из загрязнённой зоны, по сравнению с животными  из чистой зоны (p<0,001; Рис. 1Б).


В модельных экспериментах при экс­позиции молоди осетров в загряз­нён­ной нефтью воде в течение 5 сут не от­ме­чалось увеличения уровня мик­ро­ядер в эритроцитах (Рис.2А). При этом уро­вень СМАБ в печени под­опыт­ных животных не отличался от контрольного (Рис. 2Б). В то же время в груп­п­­е животных, содер­жав­шихся в загрязнённой неф­тью воде на протяже­нии 15 сут, наблюдалось резкое увеличение коли­чества мик­ро­ядер в эритро­цитах (p<0,01; Рис. 2A), сопровождавшееся замет­ным сниже­нием уровня СМАБ в печени (p<0,01; Рис. 2Б).

 

Результаты проведенных исследований позволили придти к заключению о том, что при воздействии на организм неблагоприятных факторов сниже­ние активности серотонинергической системы в тканях орга­низма является неотъемлемой частью возрастания уровня мутагенных изме­не­ний. Для выяв­ления роли активности серотонинергической системы в формировании мута­генных изменений в тканях были проведены эксперименты, в которых осу­щес­твляли избирательную блокаду активности СМАБ с помощью поликло­нальных анти­тел.

В этих экспериментах двукратное внутримышечное введение антител к СМАБ приводило к значительному увеличению (на 56%) количества микро­ядер в эритроцитах мо­лоди осе­т­ров по сравнению с животными, которым в таком же количестве вво­дили не­им­­мунные γ-глобу­лины (p<0,01; Рис. 3). При этом, введение неим­мунных γ-глобу­линов вызывало увеличение уровня мик­ро­ядер в эритроцитах относительно этого показателя интак­тных живот­ных (p<0,05; Рис. 3), свидетель­ст­ву­­ющее о наличии токсических эф­фек­­­­тов у ис­поль­зо­ван­ных гетерологи­чес­ких неиммунных γ-глобу­линов и ан­ти­тел. Полу­чен­­ные результаты продемон­ст­ри­ро­вали, что инги­би­рование ак­тив­но­сти се­ро­­тонинергической сис­темы ин­ду­ци­рует возник­новение мутаген­ных изме­не­ний в тканях и что сниже­ние актив­ности этой системы мо­жет ле­жать в ос­но­ве меха­низма фор­миро­ва­ния мута­ций в клетках различных тканей при воз­действии на орга­низм небла­го­при­ят­ных факторов окру­жающей среды.


Из литературы известно, что формирование микроядер в результате воз­действия на организм живот­ных неблагоприятных факторов происходит в пе­ри­­од кле­точного деления [11, 12, 13]. Возможно, это обусловлено большей уязвимостью хроматина в связи с кон­фор­мацион­ными перестройками, кото­рые он претерпевает в этот период кле­точного цикла. В тканях зрелого орга­низма пролиферативная активность кле­ток, как извест­но, снижена. вместе с тем, вследствие того, что серо­то­нин реа­лизует свои фун­­кции внутри клеток посредством модуляции актив­ности от­дельных генов [14], снижение его уровня под влиянием неблагоприятных фак­торов, вероятно, будет спо­соб­ствовать вклю­чению генов, которые активно функци­они­руют на эм­бри­ональ­ных ста­диях развития, что приведёт к обрете­нию зре­лыми клетками свой­ств, присущих эмбриональ­ным, в част­ности, вы­со­кой про­ли­феративной актив­но­сти. В условиях эксперимента бы­ла, в част­ности, про­де­монстри­ро­вана спо­собность миобластов мышей к де­диф­­фе­рен­ци­ации с утра­той ими спе­ци­фи­чес­ких миогенных мар­керов (MyoD и мио­зин) и предот­вращением наступ­ления последующих эта­пов клеточной дифферен­циации – форми­рова­ния мышеч­ных трубок [15]. Из сказанного сле­дует, что образование мик­ро­ядер в условиях воздействия на организм небла­­­го­при­ятных фак­торов может быть обусловлено опосредованное сни­женным уров­нем ак­тив­­ности се­­­­­­ро­­тонинер­гической системы переключением работы зре­лых кле­ток на ре­жим высокой митотической активности, по­вы­­­­шающей риск воз­ник­нове­ния му­тагенных повреждений генетического аппарата.

Подтверждением пра­во­мочности предложенного механизма возникно­ве­ния мутагенных измене­ний под влиянием неблагоприятных факторов явля­ются результаты воздей­ствия антител к СМАБ на уровень микро­ядер у мо­лоди осетров. Целью данной серии исследований являлось моделирование влияния неблагоприятных факторов на уровень микроядер путём одного толь­­ко искус­ст­венного снижения активности серотонинергической системы. Значительное увеличение уровня микроядер в эритроцитах в условиях бло­ка­ды СМАБ ан­тителами отно­сительно группы животных, которым вводили кро­личьи неим­мунные γ-глобулины (что, таким образом, исключает неспе­ци­фический ха­рак­тер эффектов ге­теро­ло­гичных антител), сви­­­детельствует о том, что сни­жение уровня СМАБ в пече­ни бычков и осетров, под­вер­гнутых длитель­ному воздействию промышленного и нефтяного загрязнения, носит не сопут­ству­ющий харак­тер, а, вероятно, является меха­низмом, запус­каемым небла­го­при­ятными фак­то­рами и реализующим мута­генные поломки в моди­фици­рован­ном генети­ческом аппарате.

В рамках описанной схемы становятся понятными результаты ранее проведенных исследований, в которых был продемонстрирован антимута­ген­ный ха­рактер вли­я­ния экзогенно введённого СМАБ, повышающего вну­три­кле­точ­ную актив­ность серотонинергической системы [16]. В этом случае, пре­д­­ва­­рительное введе­ние СМАБ молоди осетров, подвергнутым воз­дей­ст­вию небла­гоприятных факторов химической природы, вероятно, индуциро­вало пе­ре­вод клеток в фазу митотического покоя и соот­вет­ству­ющие конфор­ма­ци­онные пере­­ст­ройки хроматина, обеспечиваю­щие его защи­ту от мута­ген­ных повреждений.  

Литература

1.      De Boeck G., Nilsson G.E., Vlaeminck A., Blust R. Central monoaminergic res­ponses to salinity and temperature rises in common carp // J. Exper.Biol. 1996. V. 199, № 7, p.1605-1611.

2.       Handy R.D. Chronic effects of copper exposure versus endocrine toxicity: two sides of the same toxicological process?// Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrated Physiology, 2003, V. 135, № 1, pp. 25-38.

3.      Tsai C.L., Jang T.H., Wang L.H. Effects of mercury on serotonin concentration in the brain of tilapia, Oreochromis mossambicus.// Neurosci Lett., 1995, V. 194, № 3, pp.208-211.

4.      Fingerman M., Jackson N. C. and Nagabhushanam R. Hormonally-regulated functions in crustaceans as biomarkers of environmental pollution.// Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrynology, 1998, V. 120, № 3, pp. 343-350.

5.      Nepomuceno J.C., Ferrari I., Spano M.A., Centeno A.J. Detection of micro­nuc­lei in peripheral erythrocytes of Cyprinus carpio exposed to metallic mer­cury.// Environ. and Mol. Mutagenesis. 1997, V. 30, № 3, pp. 293-297.

6.      Bickham J.W., Sandhu S., Herbert P.D.N., Chikhi L., Athwal R. Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural populations: implication for biomonitoring and ecotoxicology.// Mutation Res., 2000. V. 463, p. 33-51.

7.      Мехтиев А.А. Обнаружение в головном мозге крыс белка, обладающего ан­­ти­консолидационными свойствами // Бюллетень экспер. биол. мед. 2000. т. 129,  № 8, с. 147-150.

8.      Гасанов Г.Г., Мехтиев А.А. Выявление серотонин-модулируемой бел­ковой фракции и изучение её участия в организации поведения пассивного избегания // Бюллетень экспер. био­л. мед., 1991, т. 112, № 7, с. 5-7.

9.      Мехтиев А.А., Козырев С.А., Никитин В.П., Шерстнёв В.В. Изби­ра­тельное влияние антител к белку SMP-69 на активность коман­дных нейронов оборонительного поведения виноградных ули­­ток // Российский физиол. журнал им. И.М.Сеченова, 2003, т. 89, № 4, с. 389-396.  

10.  Скоупс Р. Методы очистки белков. М., 1985, с. 173-178.

11.  Paglin S., Delohery T., Erlandson R., Yahalom J. Radiation-induced micro­nuclei formation in human breast cancer cells: dependence on serum and cell cycle distribution // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 237, № 3, P. 678-684.

12.   Kasuba V., Rozgaj R.. Micronucleus distribution in human peripheral blood lymphocytes treated in vitro with cadmium chloride in G0 and S phase of the cell cycle // Chemosphere. 2002. V. 49, № 1, P. 91-95.

13.   Banasik A., Lankoff A., Piskulak A., Adamowska K., Lisowska H., Wojcik A. Aluminum-induced micronuclei and apoptosis in human peripheral-blood lym­phocytes treated during different phases of the cell cycle // Environ. Toxicol. 2005. V. 20, № 4, P. 402-406.

14.  Barziali A., Kennedy T.E., Sweatt J.D., Kandel E.R. 5-HT modulates protein synthesis and the supression of specific proteins during long-term facilitation in Aplysia sensory neurons.// Neuron. 1999, V. 2, p. 1577-1586.

15.  Chen Sh., Zhang Q., Wu X, Schultz P.G., Ding Sh. Dedifferentiation of lineage-committed cells by a small molecule // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126, № 2, p. 410-411.

16.   Мехтиев А., Мовсум-заде С. Антиму­та­генная активность серотонин­ергической системы и подлежащие механизмы у молоди осетров (Acipen­ser gueldenstaedti persicus) и серебряных карасей (Carassius auratus).// Журнал эволюц. биохимии и физиологии. 2008, т. 44, № 5, c.476-481.

 

Основные термины (генерируются автоматически): молоди осетров, effects of, and oil pollution, industrial and oil, уровня СМАБ, of serotonergic system, biochemistry and physiology, Comparative Biochemistry and, активности серотонинергической, неблагоприятных факторов, of animals, активности серотонинергической системы, Мехтиев А.А, gueldenstaedti persicus, activity of serotonergic, and sturgeon juveniles, environmental factors and, exposure of animals, that downregulation of, of ant-SMAP polyclonal.

Ключевые слова

Серотонин-модулирующий белок антиконсолидации (SMAP), Мутагенные изменения, Промышленное и нефтяное загрязнение, Поликлональные антитела к SMAP

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle
Задать вопрос