Библиографическое описание:

Дубина Е. В., Шиловский В. Н., Зеленский Г. Л., Харченко Е. С., Рубан В. Я., Есаулова Л. В., Максименко Е. П., Никитина И. Б. Создание новых резистентных форм Oryza sativa l. к Magnaporthe grisea (Herbert) Barr. с использованием методов молекулярного маркирования // Молодой ученый. — 2015. — №9.2. — С. 15-20.

Проведено введение и пирамидирование генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta, Pi-b в генотипы отечественных сортов риса. ДНК-маркерный анализ позволил выявить устойчивые к болезни образцы риса, несущие 3 целевых генов в гомозиготном состоянии. Разработана система мультиплексной ПЦР для идентификации в гибридном потомстве одновременно двух генов устойчивости к патогену Pi-1+Pi-2, Pi-ta+Pi-33, Pi-ta+Pi-b.

Ключевые слова: рис, гены устойчивости к пирикуляриозу, SSR- маркеры, мультиплексная ПЦР.

 

ВВЕДЕНИЕ

Несовершенный гриб Magnaporthe grisea (Herbert) Barr Yaegashi &Udagawa (анаморф Pyricularia grisea, пирикуляриоз) является фитопатогеном широкого спектра действия, охватывающего большинство семейств сельскохозяйственных культур, в том числе и риса. Экономический ущерб, наносимый заболеванием, значителен во всех зонах мирового рисосеяния и достигает высоких цифр [1].

Создания «иммунных» сортов риса — источников устойчивости к данному патогену и быстрое внедрение их в производство является наиболее перспективным решением в борьбе с этим заболеванием. Их возделывание позволит сократить до минимума применение фунгицидов на рисовых полях и обеспечит пищевую безопасность продукции рисовой отрасли.

Однако, обеспечение устойчивости — одно из самых трудных направлений селекции. Вредители и особенно болезни имеют большой потенциал изменчивости, что в сочетании с их колоссальными способностями к размножению обеспечивает патогену высочайшие приспособительные возможности [2].

Объединение нескольких эффективных генов устойчивости на генетической основе элитных сортов — это результативная стратегия селекции на устойчивость к высоковариабельным грибным патогенам.

По многолетним исследованиям фитопатологов гены рисоспецифической устойчивости к пирикуляриозу Pi-zt, Pi-ta2, Pi-b и Pi-ta являются эффективными для юга России [3]. Гены Pi-taи Pi-b сиквенированы. Гены Рi-1, Рi-2, Рi-33 относят к генам широкого спектра резистентности риса к патогену [4]. Исследования показывают, что наибольший эффект перечисленные гены проявляют при совместном действии [5, 6].

Сорта риса, возделываемые на территории юга России, не обладают вышеуказанными эффективными генами устойчивости.

В связи с этим целью данной научной работы является создание устойчивых к пирикуляриозу сортов и линий риса с использованием методов молекулярного маркирования.

Исходя из поставленной цели, в ходе исследований предусматривалось выполнение следующих задач:

1. Выполнить программу по введению и пирамидированию генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta, Pi-b в отечественные, высокопродуктивные сорта риса.

2. Провести оценку созданного селекционного материала на наличие в генотипе вышеуказанных генов методом ПЦР.

3. Разработать системы мультиплексной ПЦР для идентификации в гибридном потомстве одновременно несколько выше указанных генов.

4. Оценить созданный селекционный материал по комплексу количественных признаков в условиях вегетационного и полевого опытов.

5. Выполнить фитопатологический тест для оценки созданного селекционного материала на устойчивость к краснодарской популяции патогена.

МЕТОДИКА.

В качестве доноров переносимых генов устойчивости (отцовская форма) использовали линии зарубежной селекции C101-A-51 (донор гена Pi-2), C101-Lac (донор генов Pi-1, Pi-33), IR-36 (донор гена Pi-ta), BL-1 (донор гена Pi-b). Предварительная оценка линий-доноров на чувствительность к местной популяции возбудителя пирикуляриоза, путём инокуляции растений риса культурой гриба, показала устойчивость тестируемых линий. Однако в условиях юга России данные линии-доноры проявили себя как позднеспелые, с вегетационным периодом 140–155 дней и характеризовались низкой фертильностью. В местной зоне рисосеяния возможно возделывание сортов, созревающих не более чем за 125 дней.

Материнской формой послужили высокопродуктивные районированные сорта риса Флагман и Снежинка.

При гибридизации растений использовали пневмокастрацию материнских форм и опыление «ТВЕЛЛ» — методом [2].

Из листовой пластинки гибридных растений ВС-популяций всех комбинаций были выделены образцы ДНК СТАВ-методом с модификациями [7]. Экстракцию ДНК проводили буфером следующего состава: 1М Tris-HCl (pH 7.5), 5M NaCl, 0.5M EDTA (pH 8.0), 10 % SDS. Часть листа (2–3см) растирали в 500 мкл экстрагирующего буфера в пластиковой пробирке объемом 1,5 мл. Образцы инкубировали при 65º С в течение 3 часов. Затем охлаждали до комнатной температуры. Супернатант отделяли центрифугированием при 12000 об/мин. К перенесенной в чистую пробирку верхней фазе добавляли 250 мкл изопропанола, оставляли на 10 минут, предварительно перемешав. После этого образец центрифугировали 5 минут при 12000 об/мин, полученный осадок промывали 250 мкл 70 % этанола, высушивали и растворяли в 50 мкл 0,1*ТЕ. В ПЦР смесь добавляли по 3 мкл раствора ДНК, выделенного данным методом.

ПЦР проводили по стандартной методике, но с предварительной оптимизацией её параметров.

При подборе комбинаций молекулярных маркеров, вносимых в реакционную смесь, учитывали их температуру отжига; разницу в размерах ПЦР-продуктов, синтезируемых в ходе амплификации с праймерными парами и самокомплементарность их последовательностей.

В ПЦР смесь вносили как смесь ДНК сортов-стандартов с целевыми генами устойчивости, так и ДНК гибридных образцов, несущих комбинацию генов Pi-1+Pi-2, Pi-33+Pi-ta, Pi-ta+Pi-b.

На начальном этапе нами были апробированы ДНК-маркеры на два гена Pi-1+Pi-2 (рис.1), Pi-33+Pi-ta (рис.2),Pi-ta+Pi-b (рис. 3) резистентности к патогену. Для идентификации генов Pi-1, Pi-2, использовали известные из литературных источников праймерные пары фланкирующих микросателлитных SSR-маркеров RM224+ RM527+SSR140 (сиквенс праймерных пар доступен на сайте gramene.com). Для идентификации генов Pi-33+Pi-ta использовали праймерные пары фланкирующих микросателлитных SSR-маркеров RM310+RM72 + праймерные пары кодоминантного SSR — маркера PitaF1/PitaR1 и PitaF2/PitaR2, созданного в нашей лаборатории [8]. Для идентификации генов Pi-ta+Pi-b — праймерные пары кодоминантного SSR — маркера PitaF1/PitaR1 и PitaF2/PitaR2 + праймерные пары кодоминантного SSR — маркера Pib4, Pib5 и Pib6, также созданного в нашей лаборатории [9, 10].

Мультиплексную ПЦР проводили с 40–50 нг ДНК, 0,1 µМ dNTPs, 25mM KCL, 60 mM Tris-HCL (pH 8,5), 0,1 % Тритон Х-100б 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1,5 mM MgCL2, 1 единица Taq-полимеразы и 0,3 µМ праймеров в конечном объёме 25 мкл. Амплификацию осуществляли в ДНК-амплификаторе «Терцик», оптимизировав при этом условия ПЦР. Это позволяет получать высокий выход целевых амплифицированных фрагментов наряду с минимальным количеством неспецифичных амплификатов: 1) Начальная денатурация- 5 минут при 94°С -1 цикл. 2) 35 циклов: денатуация — 35 сек при 94°С; отжиг праймеров 45 сек при 60° С; синтез 30 сек при 72°С. 3) Синтез 5 мин при 72°С -1 цикл.

При электрофорезе использовали 8 %-ный полиакриламидный гель. После электрофореза гелевые пластины помещали на 20–30 минут в раствор бромистого этидия (5 мкг/мл) и фотографировали в ультрафиолетовом свете.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

На основе использования технологии ДНК-маркерной селекции (marker assisted selection — MAS — селекция с применением ДНК маркеров к генам интереса) нами проведено введение генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta, Pi-b, Pi-1, Pi-2, Pi-33 в высокопродуктивные отечественные сорта риса (Флагман и Снежинка), адаптированные к агроклиматическим условиям рисосеяния юга России. Эта стратегия была использована нами для придания этим сортам длительной устойчивости к заболеванию.

Серия проведенных скрещиваний и отборов позволила получить гомозиготные линии риса на основе сортов Флагман и Снежинка с пирамидированными генами устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta, Pi-b (рис.1–3). В течение всех циклов возвратных скрещиваний перенос доминантных аллелей каждого гена в потомстве контролировался тесно сцепленными молекулярными маркерами. Растения, в генотипе которых аллели устойчивости не обнаруживали, выбраковывали.

Для повышения экономической эффективности маркерной селекции при проведении ПЦР-анализа нами разработана система мультиплексной (мультапраймерной) ПЦР, позволяющая определять одновременно последовательности двух генов Pi-1+Pi-2, Pi-33+Pi-ta и Pi-ta+Pi-b (рис. 1–3) резистентности к Magnoporthe grisea (Herbert) Barr в геномной ДНК гибридных растений при постановке одной реакции. Это существенно снижает себестоимость анализов в количество раз, равное количеству идентифицируемых генов за одну реакцию.

На рисунке 1 представлены результаты апробации комбинации пар праймеров, фланкирующих маркерные участки целевых генов Pi-1 и Pi-2.

 

Рис. 1. Мультиплексная ПЦР на гены устойчивости к пирикуляриозу

Pi-1+Pi-2

Примечание: 1825–2400 — гибридные растения; С101- линия С101Lac-донор гена Pi-1; А-51- линия С101А-51-донор гена Pi-2; Ф — сорт Флагман.

Из электрофореграммы видно, что образец под № 2400 несёт доминантную аллель гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, все остальные анализируемые образцы на ген Pi-1 несут аллель материнской формы (сорт Флагман); у образцов под № № 1825–1820, 2389, 2399, 2392, 2376, 2381 несущих доминантную аллель гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-2, присутствует специфичный для неё ПЦР-продукт. Чёткость идентификации на электрофореграмме даёт возможность безошибочно определить наличие доминантных аллелей целевых генов.

На рисунке 2 представлены результаты мультиплексной ПЦР на присутствие в одном генотипе одновременно двух генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-33+Pi-ta.

 

Рис. 2. Мультиплексная ПЦР на гены устойчивости к пирикуляриозу

Pi-33+Pi-ta

Примечание: 1827……2375 — гибридные растения; С101- линия С101Lac- донор гена Pi-33; IR-36- линия IR-36-донор гена Pi-ta; Ф — сорт Флагман.

Из электрофореграммы видно, что у образцов под № № 1838, 1843 и 2370, несущих доминантные аллели генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-33 и Pi-ta, присутствует специфичный для них ПЦР-продукт.

На рисунке 3 представлены результаты ПЦР- анализа на наличие в этих же анализируемых гибридных образцах гена Pi-b.

Рис. 3. ПЦР на ген устойчивости к пирикуляриозу Pi-b

Примечание: 1834……6к — гибридные растения; Bl- линия BL-1- донор гена Pi-b; Ф — сорт Флагман.

Из электрофореграммы видно, что анализируемые гибридные образцы № № 1к- 6к несут доминантную аллель гена Pi-b, остальные образцы несут аллель материнской формы.

В ходе дальнейшей работы нами была апробирована и отобрана комбинация праймерных пар на гены Pi-ta+Pi-b (рис. 4, 5).

Рис. 4. Мультиплексная ПЦР на гены устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta+Pi-b

63……40 — гибридные растения; Bl- линия Bl-1- донор гена Pi-b; IR- линия IR-36-донор гена Pi-ta.

Рис. 5. Мультиплексная ПЦР на гены устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta+Pi-b

Примечание: 67……74 — гибридные растения; Bl- линия Bl-1- донор гена Pi-b; IR- линия IR-36-донор гена Pi-ta.

Из рисунков 4, 5 видно, что анализируемые гибридные образцы № № 18 и 60 несут доминантную аллель генов Pi-taи Pi-b. Чёткость идентификации на электрофореграмме даёт возможность безошибочно определить наличие доминантных аллелей целевых генов.

Разработанная мультиплексная технология идентификации одновременно нескольких генов устойчивости к пирикуляриозу внедрена нами в систему маркерной селекции риса по созданию резистентных к патогену генресурсов риса.

В текущем 2013 году в условиях полевого опыта на рисовой оросительной системе ВНИИ риса лабораторией защиты риса был проведен фитопатологический тест полученных линий с пирамидированными генами устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta, Pi-b. Инокуляцию растений проводили культурой гриба, выделенной из гербарного материала, собранного на полях Краснодарского края при 105 конидий/мл, что соответствует 10–14 спорам в поле зрения микроскопа.

Растения заражали в полевых условиях инфекционного питомника в фазы кущение, вымётывание – цветение из расчета 0,5 мл на одно растение. При обработке использовали опрыскиватель. В суспензию добавляли прилипатель Квин из расчёта 1 капля на литр воды. В качестве контроля использовали устойчивый сорт риса Авангард. Учёт степени поражения растений проводили на 14 день после инокуляции.

Оценку осуществляют, учитывая два показателя: тип реакции (в баллах), используя при этом десятибалльную шкалу Международного института риса [11]; интенсивность развития болезни ИРБ (в процентах), согласно экспресс-методу оценки сортовой устойчивости риса к пирикуляриозу [11]:

— устойчивые — 0–1 баллов — отсутствие поражения, мелкие коричневые пятна, покрывающие менее 25 % общей поверхности листьев;

— среднеустойчивые — 2–5 баллов — типичные пирикуляриозные пятна эллиптической формы, 1–2 см длиной, покрывающие 25,1–50 % общей поверхности листьев;

— неустойчивые — 6–10 баллов — типичные пирикуляриозные пятна эллиптической формы, 1–2 см длиной, покрывающие 50,1 и более % общей поверхности листьев.

Результаты фитопатологического теста, проведенного в рамках программы интродукции генов Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta, Pi-b в отечественные сорта риса Флагман и Снежинка представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты фитопатологического теста, проведенного в рамках программы интродукции генов Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta, Pi-b в отечественные сорта риса в 2013 г.

Образец

Интенсивность развития пирикуляриоза, %

Степень устойчивости

Введённые гены устойчивости к пирикуляриозу

ИРБ, %

1362 дл

Pi-2, Pi-ta

7,0

устойчив

1360

Pi-b

12,2

устойчив

2646–154

Pi-2

13,3

устойчив

1344

Pi-2, Pi-b

15,6

устойчив

1363

Pi-b, Pi-ta

15,6

устойчив

1364

Pi-b

15,6

устойчив

2661–575

Pi-2, Pi-b

16,7

устойчив

1359

Pi-2, Pi-b, Pi-ta

17,8

устойчив

1345

Pi-2, Pi-b

17,8

устойчив

Для селекции риса на современном этапе желательным является низкорослый тип растений, с высокой интенсивностью первоначального роста, устойчивый к полеганию, с высокопродуктивной метёлкой и неосыпающимися в фазу полной спелости колосками. Среди растений, которые по результатам ДНК-анализа, несли пирамидированные гены и при фитопатологической оценки на резистентность к патогену показали себя как устойчивые и среднеустойчивые, было отобрано несколько форм, совмещающих в себе скороспелость, низкорослость, неосыпаемость и фертильность колосков. Они были вовлечены в работу по схеме селекционного процесса и в 2013 году прошли испытание по комплексу признаков в контрольном питомнике.

Работа продолжается.

ВЫВОДЫ.

1.                  В результате проведенных исследований с помощью современных биотехнологических методов (молекулярное маркирование на основе ПЦР) в сочетании с традиционной селекцией в короткие сроки получены линии риса, в генотипе которых собрано три эффективных генов резистентности к пириуляриозу (Pi-2, Pi-b, Pi-ta), (Pi-2, Pi-b, Pi-33). Проведенная фитопатологическая оценка показала их устойчивость к патогену. Внедрение таких сортов в производство позволит избежать эпифитотийного развития болезни, сохранить биологическую урожайность риса и получать экологически чистую сельхозпродукцию.

2.                  Разработана схема мультиплексной ПЦР идентификации одновременно двух генов устойчивости в пирикуляриозу: Pi-1+ Pi-2, Pi-33+Pi-ta, Pi-ta+Pi-b. Её использование позволит значительно сократить затраты расходных материалов и время на выполнение анализа образцов с указанными пирамидированными генами резистентности к патогену, что повышает экономическую эффективность ДНК-маркерной селекции.

 

Литература:

1.        Зеленский Г. Л. Перспективы создания сортов риса с высокой продуктивностью и адаптивными качествами // Рисоводство.- 2003 г. –

2.        № 3. С. 11.

3.        Зеленский Г. Л. Селекция сортов риса, устойчивых к пирикуляриозу, рисовой листовой нематоде и бактериальному ожогу в условиях Российской Федерации // Автореферат диссертации на соискание ученой степени д. с.-х. наук. — Краснодар. — Тип. КубГАУ. — 1993. — 49 с.

4.        Дьяков Ю. Т., Озерецковская О. Л., Джавахия В. Г., Багирова С. Ф.//

5.        Общая и молекулярная фитопатология. Москва. «Общество фитопатологов». — 2001. 301 с.

6.        Хавкин Э. Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур // Сельскохозяйственная биология.- 2003. — № 3. — С. 26–41.

7.        Коваленко Е. Д., Горбунова Ю. В., Ковалева А. А. и др. Методические указания по оценке устойчивости сортов риса к возбудителю перикуляриоза. — М., 1988. — 30 с.

8.        Коломиец Т. М. Отбор исходного материала риса для селекции на иммунитет к пирикуляриозу // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. — Голицыно, 1990.- 21 с.

9.        Murray M. G. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA/ Murray M. G., Thompson Genomt.- V. 40.-p. 379–378.

10.    Мухина Ж. М., Токмаков С. В., Мягких Ю. А., Дубина Е. В. Создание внутригенных молекулярных маркеров риса для повышения эффективности селекционного и семеноводческого процессов.// Полиматический сетевой электронный научный журнал КубГАУ.- 2011- № 67 (03).

11.    Мухина Ж. М., Коломиец Т. М., Волкова С. А., Дубина Е. В., Супрун И. И., Токмаков С. В., Мягких Ю. А. Создание внутригенных ДНК-маркеров и их использование в практической селекции риса // Труды Кубанского государственного аграрного университета. — 2009. — № 3(22), Краснодар.- С.63–67.

12.    Ж. М. Мухина, Т. Коломиец, С. А. Волкова, Е. В. Дубина, И. И. Супрун, С. В. Токмаков, Ю.Мягких. Создание внутригенных ДНК-маркеров и их использование в практической селекции риса // Сб. Пятого Международного конгресса.- Москва, 2009. — С. 261.

13.    Лабораторный экспресс-метод оценки сортовой устойчивости риса к пирикуляриозу. А. А. Аверьянов, В. П. Лапикова, Г. Г. Петелина. — Большие Вяземы: ВНИИФ, 1990.- 12 с.

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle