Библиографическое описание:

Беловешкин А. Г. Роль телец Гассаля тимуса человека в позитивной и негативной селекции тимоцитов // Молодой ученый. — 2012. — №7. — С. 334-338.

Введение. Известно, что тимус представляет собой первичный орган иммунной системы, в котором происходит дифференцировка предшественников Т-лимфоцитов в зрелые клетки. Процесс дифференцировки обеспечивается сложным трехмерным микроокружением тимуса, состоящим из различных клеточных популяций, активно взаимодействующих как между собой посредством ряда хемокинов, адгезионых молекул и иных механизмов [3].

Одним из наименее изученных компонентов тимуса являются тельца Гассаля, которые представляют собой концентрические скопления эпителиальных клеток в мозговом веществе долек тимуса. Тельца Гассаля взаимодействуют с различными типами клеток, но их взаимодействие с тимоцитами до настоящего времени остается недостаточно изученным [4]. Так, Blau [5] считал, что тельца обладают фагоцитарной активностью и способны разрушать гибнущие тимоциты. Эта теория получила широкое распространение и явно, или неявно поддерживается большим количеством исследователей. Bodey [3] объясняет зернистость в эпителиальных клетках фрагментами разрушенных тимоцитов, не приводя удовлетворительных доказательств в поддержку этой точки зрения. Также в пользу его предположения интерпретировались такие факты как быстрое попадание ДНК тимоцитов в просвет телец и высокая активность лизосомальных ферментов в клетках телец Гассаля [3]. Несмотря на многочисленные исследования, так и не был описан механизм попадания тимоцитов в тельца Гассаля. Наряду с описанной теорией, существуют и противоположные мнения, которые доказывают, что тельца Гассаля напротив, способствуют дозреванию тимоцитов. Некоторые исследователи обращают внимание на высокую плотность тимоцитов возле телец Гассаля. Senelar [12] описал контакты клеток телец с тимоцитами и выдвинул предположение, что тельца являются местами дозревания тимоцитов.

Таким образом, существует ряд противоречий в описании как структурных особенностей взаимодействия тимоцитов с тельцами Гассаля, так и в интерпретации полученных данных. Целью настоящего исследования было выявление закономерностей взаимодействия тимоцитов и телец Гассаля тимуса человека и интерпретировать полученные результаты в свете современных научных данных.


Материалы и методы. Объектом исследования служил операционный материал тимуса, удаленный по хирургическим показаниям. Операции проводились в Минском детском кардиохирургическом центре по поводу минимальных сердечно-сосудистых пороков у детей в возрасте 1-4 месяца, в анамнезе которых отсутствовали инфекционные заболевания, иммунодефицитные состояния, прием стероидных гормонов, иммунодепрессантов.

Микроскопическое исследование проводилось с помощью компьютерного анализатора изображения на базе цифровой камеры UMD-300 («Gsmserver», Тайвань) и микроскопа Zeiss Axiolab («Carl Zeiss AG», Германия). Образцы тимуса (20 случаев) фиксировали в нейтральном формалине, заливали в парафин, готовили серийные срезы толщиной 7 мкм. Окраска препаратов проводилась гематоксилин-эозином (с модификациями для лучшей визуализации эозинофилов), по Романовскому-Гимза, кислым фуксин-альциановым синим-гематоксилином и по методу Пачини (с модификациями автора, позволяющими выявить кератиновое ядро телец Гассаля). Иммуногистохимическое исследование проводилось с антителами к CD3, CD5, CD25, CD30, CD68. Все антитела производства DAKO, США. Ядра клеток докрашивались гематоксилином.

Электронно-микроскопическое исследование проводилось на электронном микроскопе JEM 100 CX (Япония). Образцы фиксировались в 2,5% растворе глютаральдегида и 1% растворе четырехокиси осмия и заливались в аралдит. Срезы изготавливали на ультратоме ЛБК (Швеция) и контрастировали цитратом свинца.


Полученные результаты. Использование маркера CD3, который является общим для всех Т-лимфоцитов, показало, что лимфоциты в мозговом веществе распределены достаточно равномерно, однако периферический слой телец Гассаля окружен лимфоцитами плотно (рисунок 1а). В полости телец тимоциты, за редким исключением, отсутствуют. Часто можно обнаружить CD3-положительные клетки между эпителиоцитами телец. Таким образом, тимоциты не вносят существенного вклада в строение телец и структурное взаимодействие между ними выражено незначительно.

Тем не менее, исследование определенных субпопуляций тимоцитов показало их концентрацию возле телец Гассаля (рисунок 1б, 1в). Плотность тимоцитов субпопуляций CD25 и СD30 встречаются возле телец Гассаля намного чаще, чем в других отделах мозгового вещества. При ультраструктурном исследовании на периферии тельца Гассаля обнаруживается тесное взаимодействие тимоцитов с микроворсинками эпителиальных клеток. Ультрамикроскопическое исследование выявило большое количество тимоцитов возле периферических клеток, причем отростки тимоцитов контактируют с микроворсинками эпителиальных клеток и мембраной многочисленных дендритных клеток. Часто можно наблюдать непосредственный контакт клеточных мембран. Данные наблюдения могут свидетельствовать о тесном взаимодействии данных типов клеток.

Рис. 1. Различные субпопуляции тимоцитов в мозговом веществе тимуса. Иммуногистохимическая реакция на CD3 (А), CD25 (В),CD30 (Б), гистохимическая реакция на нуклеиновые кислоты (Г). Обозначения: 1 – тельце Гассаля, 2 – имуннореактивные тимоциты, 3 – апоптотические тимоциты. Увеличение 1000х.

Рис. 2. Апоптоз тимоцитов и тельца Гассаля мозгового вещества тимуса. Электронно-микроскопическое исследование. Апоптотическое тельце (А), макрофаг с фагоцитированным апоптотическим тимоцитом (Б), апоптотические тельца в полости (В) и в стенке (Г) тельца Гассаля. Обозначения: 1 – апоптотическое тельце, 2 – эпителиальная клетка тельца, 3 – полость тельца, 4 – тимоциты, 5 – макрофаг. Увеличение 10000х.


Следующим важным наблюдением было обнаружение большого количества тимоцитов на различных стадиях апоптоза (рис. 2). Апоптотические тимоциты встречаются возле телец Гассаля намного чаще, чем в других отделах мозгового вещества. При гистологических методах окраски, хорошая визуализация апоптоза достигается при использовании гистохимических методов окраски на нуклеиновые кислоты (рисунок 1г). Ультрамикроскопически можно обнаружить апоптотические тимоциты как в виде отдельных апоптотических телец, так и в виде клеток с конденсированным хроматином. Топография апопоптотических тимоцитов различна: преимущественно они встречаются непосредственно возле периферического слоя телец Гассаля, реже – между эпителиальными клетками и еще реже – в полости телец регрессивного типа (рисунок 2). При этом часто обнаруживаются апоптотические тельца в цитоплазме макрофагов (рисунок 2б). Ранее [1] мы упоминали, что CD 68-положительные макрофаги в мозговом веществе сконцентрированы возле телец Гассаля всех стадий развития, а не только возле стареющих форм, в разрушении которых они принимают участие. Таким образом, объяснением этого наблюдения, может быть фагоцитоз макрофагами погибающих апоптозом тимоцитов. Плотность макрофагов в мозговом веществе намного ниже, чем в корковом веществе, что, на наш взгляд, отражает различия в интенсивности апоптоза в данных зонах.


Обсуждение полученных результатов. Полученные результаты подтверждаются данным исследования апоптоза в тельцах с помощью TUNEL-метода [7]. Он показал, что все CD3-положительные клетки в тельцах являются апоптотическими, причем принадлежат они различным субпопуляциям (CD4+ CD8+ CD4+CD8+). Таким образом, тельца участвуют в утилизации различных типов аутореактивных тимоцитов. Doulek также показал, что тельца – это единственное место апоптоза в мозговом веществе тимуса. Движение тимоцитов in vivo с помощью двухфотонной микроскопии позволяет проследить движение отдельных клеток [4]. Показано, что после взаимодействия с дендритными клетками, тимоцит не сразу подвергается апоптозу а еще некоторое время мигрирует по мозговому веществу. Для объяснения полученных данных необходимо привлечь исследования по хемокинам, регулирующим миграцию тимоцитов.

Тельца Гассаля секретируют несколько важных для движения тимоцитов хемокинов [2, 8]. К их числу относятся MDC (macrophage-derived chemokine, хемоаттрактиант для CD4+CD30+ клеток) и Mig (хемоатрактант для CD8 клеток и NK-клеток). Они действуют следующим образом. Так, при попадании тимоцитов в мозговое вещество, тимоцит проходит процесс негативной селекции, взаимодействуя с дендритными клетками. Если тимоцит несет Т-клеточный рецептор, потенциально реактивный к своим антигенам, то при взаимодействии с дендритной клеткой, происходит его активация. Тимоциты, активированные аутогомологичными пептидами продуцируют ИЛ-4, который ауто- и паракринно вызывает высокую экспрессию рецептора CD30, относящегося к суперсемейству TNF- рецепторов. Тимоциты, экспрессирующие CD30 становятся чувствительны к действию MDC и мигрируют непосредственно к тельцам Гассаля. Клетки, входящие в состав телец Гассаля и единичные эпителиоциты мозгового вещества продуцируют большие количества CD30L. Взаимодействие CD30L\CD30 индуцирует апоптоз аутореактивных тимоцитов, который и происходит непосредственно возле телец Гассаля [8]. Отметим, что нарушение экспрессии CD30 приводит к развитию аутоиммунных заболеваний. Таким образом, описанный механизм позволяет объяснить наблюдаемые морфологические особенности взаимодействия тимоцитов с тельцами Гассаля.

Однако не все аутореактивные тимоциты погибают, часть из них дифференцируется в Т-регуляторы, клетки, которые эффективно регулируют активность иммунного ответа на периферии и являются дополнительным механизмом поддержания центральной толерантности, так как тельца Гассаля играют важную роль в дифференцировки Т-reg. Тельца Гассаля синтезируют TSLP (тимический стромальный лимфопоэтин) [13]. Этот хемокин вызывает созревание дендритных клеток, ответственных за образование T-регуляторов из высоко- и средне- аутореактивных тимоцитов. Отметим, что антигены Т-регуляторам предоставляются напрямую эпителиальными клетками телец, без межклеточного переноса антигенов и участия дендритных клеток. Таким образом, тельца Гассаля играют главную роль во вторичной позитивной селекции из высоко- и средне- аутореактивных тимоцитов, результатом которой является образование CD4+CD25+ регуляторных T-лимфоцитов в тимусе, которое в большой степени определяет и периферический репертуар Treg в организме. Таким образом, наблюдаемая нами концентрация CD25-положительных клеток возле телец Гассаля также получила полное объяснение.

Хемокин Mig [9] также синтезируется клетками телец Гассаля, но привлекает другие субпопуляции тимоцитов (зрелые CD8 клетки и NK-клетки). Так как тельца синтезируют IL-7 и ТGF-β, которые стимулируют выживание и пролиферацию зрелых тимоцитов, то их взаимодействие с тельцами может способствовать активации указанных субпопуляций тимоцитов [10]. IGF-1 также демонстрируют высокий уровень экспрессии, который оказывают антиапоптотический эффект на развивающиеся тимоциты [13].


Заключение. Таким образом, при исследовании взаимодействия телец с тимоцитами было выявлены несколько структурных закономерностей взаимодействия телец Гассаля и тимоцитов.

1. Тимоциты принимают незначительное участие в морфогенезе телец Гассаля, редко встречаясь между эпителиальными клетками телец, и, еще реже, в полости телец.

2. Обнаружены ультраструктурные данные, свидетельствующие о тесном взаимодействии эпителиальных клеток телец и тимоцитов.

2. Концентрация CD25+ и CD30+ субпопуляций тимоцитов возле телец Гассаля выше, чем в других отделах мозгового вещества.

2. Наблюдался высокий уровень апоптоза тимоцитов возле телец Гассаля и поглощение апоптотических телец макрофагами.

Следовательно, результаты настоящего исследовании и данные литературы свидетельствуют о том, что тельца Гассаля оказывают разнообразное влияние на развивающиеся тимоциты. Они являются компонентом системы по утилизации аутореактивных клеток, синтезируют хемокины, влияющие на миграцию тимоцитов, осуществляют прямую антигенпрезентацию. Предлагаемый алгоритм взаимодействия клеток в рамках негативной селекции позволяет интерпретировать полученные экспериментальные данные и укладывается в рамки современных представлений о процессах позитивной и негативной селекции в мозговом веществе тимуса человека.


Литература:

  1. Беловешкин А.Г., Стельмах И.А. // Участие макрофагов в процессе разрушения телец Гассаля тимуса человека. БГМУ: 90 лет в авангарде медицинской науки и практики: сб. научных трудов, Минск: ГУ РНМБ, 2001, т.1, стр. 88-89.

  2. Annunziato Francesco, Paola Romagnani, Lorenzo Cosmi, Chiara Beltrame, Macrophage-Derived Chemokine and EBI1-Ligand Chemokine Attract Human Thymocytes in Different Stage of Development and Are Produced by Distinct Subsets of Medullary Epithelial Cells: Possible Implications for Negative Selection The Journal of Immunology 1, 2000 vol. 165 no. 1 238-246.

  3. Bodey B, Bodey B Jr, Siegel SE, Kaiser HE: Novel insights into the function of the thymic Hassall’s bodies. In Vivo 2000 14: 407-418.

  4. Borgne Marie Le, Ena Ladi, Ivan Dzhagalov, Paul Herzmark, Ying Fang Liao, Arup K Chakraborty Ellen A Robey The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla Nature Immunology 10, 823 – 830 (2009).

  5. Blau J N. A phagocytic function of Hassall’s corpuscles. Nature. 1965; 208:564.

  6. Bhatia S K, Tygrett L T, Grabstein K H, Waldschmidt T J. The effect of in vivo IL-7 deprivation on T cell maturation. J Exp Med. 1995; 181: 1399.

  7. Douek Daniel C. and Daniel M. Altmann. T-cell apoptosis and differential human leucocyte antigen class II expression in human thymus Immunology. 2000 February; 99(2): 249–256.

  8. Romagnani Paola, Francesco Annunziato, Roberto Manetti. High CD30 Ligand Expression by Epithelial Cells and Hassal's Corpuscles in the Medulla of Human Thymus \\ Blood. – 1998 – Vol. 91 No. 9. – рр. 3323-3332.

  9. Romagnani Paola, Francesco Annunziato, Elena Lazzeri, Lorenzo Cosmi. The Journal of Immunology \\ Interferon-inducible protein 10, monokine induced by interferon gamma, and interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant are produced by thymic epithelial cells and attract T-cell receptor (TCR) CD8+ single-positive T cells, TCR + T cells, and natural killer-type cells in human thymus. – 2001 – Vol. 168 – рр 2609-2617.

  10. He W, Zhang Y, Deng Y, Kabelitz D. Induction of TCR-gamma delta expression on triple-negative (CD3-4-8-) human thymocytes. Comparative analysis of the effects of IL-4 and IL-7. J Immunol. 1995 Apr 15; 154(8):3726-31.

  11. Surh CD, Sprent J: T-cell apoptosis detected in situ during positive and negative selection in the thymus. Nature372 :100 –103,1994.

  12. Senelar R, Escola MJ, Escola R, Serrou B, Serre A. Relationship between Hassall's corpuscles and thymocytes fate in guinea-pig foetus. Biomedicine. 1976 24(2): 112-22.

  13. Watanabe N, Wang YH, Lee HK, Ito T, Wang YH, Cao W, Liu YJ. Hassall's corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+CD25+ regulatory T cells in human thymus Nature. 2005 25;436(7054):1181-5.
Основные термины: телец Гассаля, телец Гассаля, телец Гассаля тимуса, телец Гассаля тимуса, тельца Гассаля, тельца Гассаля, аутореактивных тимоцитов, Гассаля тимуса человека, Гассаля тимуса человека, клетками телец, полости телец, аутореактивных тимоцитов, мозгового вещества, мозгового вещества, взаимодействия тимоцитов, классификации телец Гассаля, мозговом веществе, полости телец, субпопуляций тимоцитов, клеток телец

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle