Протеазы или протеолитические ферменты — это группа ферментов класса гидролаз, катализируют внутри- и внеклеточное расщепление (протеолиз) пептидных связей C(O)–NH в белках и пептидах живых организмов [2].
Протеолитические ферменты играют важнейшую роль в переваривании белков пищи в желудке и кишечнике человека. Большинство протеолитических ферментов органов пищеварения продуцируется в виде проферментов. Физиологический смысл этого заключается в том, чтобы акт продукции фермента (профермента) был отделен от акта его активации — превращения в фермент и, таким образом, белки тканей, продуцирующих ферменты, не подвергались воздействию этих самых ферментов [3].
Изучение протеазы является значимой, так как поиск микроорганизмов и определение вырабатываемых ими ферментов являются ключевыми шагами для развития производства кормов, удобрений и стимуляторов роста растений и микроорганизмов.
Исследовательская работа была направлена на определение протеолитической активности протеазы термофильной бактерии штамма Bacillus pumilis 22СП-1–0576-А3 и её влияния на активацию спор и образование колоний азотфиксирующих бактерий.
В 2022–2023 учебном году, в рамках Всероссийского проекта «Атлас почвенных микроорганизмов» ученица 11 класса нашей школы, Писарева Софья выполняла проект «Изучение активности азотфиксирующих бактерий в почвах ризосферы естественных экосистем и их влияние на прорастание семян растений» [1]. В рамках этого проекта, в образце, отобранном в ризосфере дуба, были выявлены термофильные бактерии. Активность термофильных бактерий в ризосфере дуба составила 1,6 %. Плашки с данными образцами были отправлены для дальнейшего исследования учёным в ИХБФМ СОРАН, в г. Новосибирск, где было выявлено, что она проявляет протеолитическую активность.
Далее, в лабораторных условиях, ИХБФМ СОРАН г. Новосибирск, полученный образец отделили от колонии бактерий и выделили бактерию с хорошей протеазной активностью. По полученным данным установили, что данная бактерия относится к виду Bacillus pumilis . Штамм назван по номеру образца почвы, зарегистрированном в «Атласе микроорганизмов» — 22СП-1–0576-А3. Проведя ПЦР анализ нуклеотидной последовательности выделенной бактерии, определили, что в ее геноме присутствуют несколько генов обычных протеаз, а также ген термофильной протеазы.
На базе регионального центра «Альтаир» — парка науки и технологий в феврале 2023г., под руководством Ворониной Еленой Николаевной были проведены исследования для протеазы штамма Bacillus pumilis 22СП-10576-А3 по определениюоптимальной температуры, оптимальной pH и определению зависимости активности протеазы от ионов металлов.
Для определения активности протеазы пробирки инкубировали при температурах 10 С˚ до 75 С˚, затем останавливали реакцию и центрифугировали. Супернатант переносили в лунку, добавляли NaOH, после добавления NaOH наблюдали изменение интенсивности цвета образцов. Затем снимали интенсивность поглощения растворов на спектрофотометре при длине волны 430нм (оранжевый свет). Результаты показали, что оптимальная температура для протеазы — от 37 до 65°C, с максимальной активностью при 45°C. Результаты представлены на рисунке 1.
Рис. 1. Активность протеаз при разных температурах
Для определения оптимального pH протеазы Bacillus pumilis 22СП-1–0576-А3 провели эксперимент с 28 пробирками, добавляя базовый раствор с разным pH. Пробирки инкубировали при 37°C. Затем снимали интенсивность поглощения растворов на спектрофотометре при длине волны 430нм (оранжевый свет). Результаты показали, что оптимальная pH для протеазы состовляет от pH 7–10. Результаты представлены на рисунке 2.
Рис. 2. Активность протеазы при разной pH
Для изучения зависимости активности протеазы от ионов металлов провели эксперимент с добавлением различных концентраций ЭДТА в пробирки без CaCl2 и MgCl2. Пробирки инкубировали при 37°C, после добавления NaOH наблюдали изменение интенсивности цвета образцов. По изменению цвета было определено, что изучаемая протеаза не зависит от ионов магния и кальция, но возможно зависит от других ионов так, как ЭДТА ингибирует протеазу, замедляя протеолитическую активность (см. рис. 3).
Рис. 3. Зависимость активности протеазы от ионов метала
Оценка влияния присутствия термофильных штаммов, на активность образования колоний азотфиксирующих бактерий была проведена на образцах почв ризосферы дуба, осины и сосны, которые были отобраны в августе 2022 года и использовались для выявления термофильных бактерий.
Чашки Петри с почвенными комочками были размещены при температурах 25С˚ и 40С˚. В образцах почвы ризосферы дуба, расположенных в контейнере при температуре 40С˚, по сравнению с образцами, расположенными в контейнере при комнатной температуре 25С˚, активность азотфиксирующих бактерий выше в 3 раза. Азотфиксирующие бактерии в образцах почвы ризосферы осины и сосны показали примерно одинаковую активность при данных условиях.
В образцах почвы ризосферы дуба, расположенных при температуре 40С˚, по сравнению с образцами, расположенными при комнатной температуре 25С˚, активность азотфиксирующих бактерий выше в 20 раза (см. рис 4).
Рис. 4. Образование светлых колоний в азотфиксирующих бактерий на 4 день
Предполагаем, что данная активность азотфиксирующих бактерий в почве ризосферы дуба, связана присутствием в данной почве термофильных бактерий, в том числе бактерии Bacillus pumilis, которая продуцирует термофильную протеазу. Можно предположить, что протеаза, выделяемая бактериями Bacillus pumilis, стимулирует активность образования колоний азотфиксирующих бактерий, в образцах почвы отобранных более 2 лет назад.
Важно отметить, что данная протеаза обладает большим потенциалом. Она выделяется в культуральную среду, что позволяет удобно работать с ней. Кроме того, она является термостабильным ферментом и может использоваться при создании кормовых добавок для животных и как фермент для активации спор бактериальных клеток.
Мы хотели бы продолжить исследования и определили следующие задачи для реализации
– Провести скрининг термофильных протеаз почвы ризосферы дуба, инкубируя при низкой температуре, так как первоначальный скрининг был произведен при высокой температуре.
– Определить активность протеазы бактерии штамма Bacillus pumilis 22СП-1–0576-А3 в среде при концентрации pH от 0 до 3 и от 11 до 12.
– Определить зависимость активности протеазы штамма Bacillus pumilis 22СП-1–0576-А3 от ионов метала Fe, Cu и Zn.
– Определить влияние протеазы бактерии штамма Bacillus pumilis 22СП-1–0576-А3 на развитие колоний азотфиксирующих бактерий в образцах почв, отобранных более двух лет назад.
Литература:
- Писарева, С. В. Изучение активности микроорганизмов рода Azotobacter в почвах ризосферы естественных экосистем и их влияние на прорастание семян растений / С. В. Писарева, Т. С. Томбасова. — Текст: непосредственный // Юный ученый. — 2023. — № 5 (68). — С. 259-263. — URL: https://moluch.ru/young/archive/68/3754/
- Протеазы | это... Что такое протеазы? — Текст: электронный // https://academic.ru: [сайт]. — URL: https://big_medicine.academic.ru/7024/ПРОТЕАЗЫ
- Протеолитические ферменты. — Текст: электронный // https://www.gastroscan.ru/: [сайт]. — URL: https://www.gastroscan.ru/handbook/120/2894
