Биотехнологический потенциал микромицетов как продуцентов протеаз с подобной активированному протеину C и активаторной активностями

 

Proteases having an activity of activated protein C and the ability to activate protein C in human blood plasma are widely used in medicine as a replacement therapy preparations or in diagnostics. Keywords: biotechnology, the potential. However, these enzymes are often expensive or not specific enough, because a search of new sources of such enzymes, which are suitable for the role of some mikromitcety. A number of studies in recent years have demonstrated their ability to produce enough enzymes specific activity as the direct substrate of activated protein C, and operating on the activator type. Such enzymes could be more specific and cost-effective replacement for the currently used.

 

Активированный протеин С (АРС) — важнейший фактор системы гемостаза человека. Недостаток этого фермента в плазме крови ведет к нарушению постоянства ее вязкости, вследствие чего возникает повешенный риск тромбообразования. Для оценки количества протеина С в плазме крови существуют диагностикумы, в которых используются протеазы с активаторной по отношению к протеину С активностью — расщепляющие его путем ограниченного протеолиза с получением активного белка. В настоящий момент эти ферменты получают из яда змей [1,2], что подразумевает под собой ряд технических трудностей, а вследствие чего и высокую стоимость подобных препаратов. АРС сам по себе тоже находит применение в медицинской практике как препарат для заместительной терапии. В основном его используют для облегчения симптомов сепсиса. В настоящий момент для этой цели используется рекомбинантный человеческий APC (XIGRIS) [3], однако и у этого препарата выявлен ряд недостатков, в числе которых как дороговизна, так и большое количество побочных эффектов, возникающих при его введении кровь [4].

Таким образом, очевидна необходимость поиска новых как новых ферментов, обладающих более специфическим действием на систему гемостаза человека, так и новых, более рентабельных, источников для их получения. В частности, одним из перспективных источников в настоящее время считаются микромицеты.

Известно, что многие внеклеточные протеазы микромицетов обладают активностями ферментов системы гемостаза человека, и зачастую действуют высокоспецифично, не напрямую расщепляя субстрат, а активируя белки плазмы крови путем ограниченного протеолиза так же, как это происходит в физиологических условиях [5]. Известно, что ферменты Aspergillus terreus, специфически активируют прекалликреин [6], Acremonium sp. — протромбин [7], а протеазы Arthrobotrys longa обладают урокиназной активностью [8]. В настоящее время было выявлено, что протеазы микромицетов способны расщеплять субстрат активированного протеина С как напрямую, так и по активаторному типу (табл. 1).

 

Таблица 1

Активности некоторых культур микромицетов с хромогенным пептидным субстратом активированного протеина С (pGlu-Pro-Arg-pNa), на 3–4 сутки культивирования, Е/мл×10–3

Микромицет	Прямая активность	Активаторная активность	Ссылка
Aspergillus alliaceus 7dN1	0	28.4	[9]
A. nidulans 203	0	4.8	[9]
A. nidulans a1	3,94	-	[10]
A. ochraceus L1	0	65.9	[9]
A. sclerotiorum 1	0	0	[9]
A. sclerotiorum a1	2,27	-	[10]
A. terreus 2	0	64.3	[9]
A. ustus 1	24.3	-	[9]
A. versicolor 1	40.5	-	[9]
Beauveria bassiana	0,71	-	[10]
Purputeocillum lilacinum	25,84	-	[10]
Tolypocladium inflatum k1	0,82	-	[10]

 

Существенные значения прямых активностей были зарегистрированы лишь для трех из двенадцати проверенных культур. Однако A. versicolor 1 и A. ustus 1 гидролизовали широкий спектр хромогенных пептидных субстратов, что говорит о низкой специфичности их протеаз [9], в то время как в случае с Purpureocillum lilacinum можно предполагать специфическое воздействие, однако, этот вопрос требует дальнейшего изучения [10].

Наибольшие значения активаторной к субстрату АРС активности были показаны для микромицетов A. ochraceus и A. terreus, однако дальнейшее изучение выявило, что протеаза A. terreus активирует не протеин С, а прекалликреин [10, 6].

Скрининг среди различных штаммов A. ochraceus показал, что образование протеаз с активаторной к протеину С активностью характерно для изолятов данного вида. Ферменты этого микромицета не способны гидролизовать хромогенный пептидный субстрат протеина С напрямую, однако реакция с субстратом происходит в присутствии плазмы крови, что подтверждает предположение именно об активаторной активности. Показано, что из всего ферментного комплекса гриба, активаторной к протеину С активностью обладает только одна протеаза [9]. В дальнейшем данный фермент был выделен и охарактеризован. Он представляет собой негликозилированный белок с узкой субстратной специфичностью по отношению к протеину С, молекулярной массой 33 кДа, и оптимумом активности при рН 8.0–9.0 и 37оС. Протеаза по своим свойствам оказалась сравнима с ферментом, получаемым из яда змей, однако не проявляла активности с хромогенным пептидным субстратом плазмина [11].

Данные результаты могут иметь большое коммерческое значение, поскольку грибные протеазы просты в получении и разнообразны, что дает возможность получать в достаточной мере специфичные протеазы микробиологическим путем, что сделало бы производство препаратов более рентабельным.

 

Литература:

 

1.                Stoker K., Fisher H., Meier J., Brogli M., Svedsen L. // Toxicon. 1987. V. 25. P. 239–252.
2.                Lindhout M. J., Kop-Klaassen B. H. M., Hemker H. C. // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 533. P. 327–341.
3.                Bernard G. R.. Vincent J.-L., Laterre, P.-F., La Rosa S. P., Dhainaut J.-F., Lopez-Rodriguez A., Steingrub J. S., Garber G. E., Helterbrand J. D., Ely E. W., Fisher C. J. // N Engl J Med. 2001. Т. 34410. Р. 699–709.
4.                Green C., Dinnes J., Takeda A., Shepherd J., Hartwell D., Cave C., Payne E., Cuthbertson B. H. Health Technol. Assess. 2005. V. 9. № 11. Р. 1–126, iii-iv.
5.                Осмоловский A. А., Крейер В. Г., Кураков А. В., Баранова Н. А., Егоров Н. С. // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48. С. 537–542.
6.                Звонарева Е. С., Осмоловский А. А., Крейер В. Г., Баранова Н. А., Котова И. Б., Егоров Н. С. // Биоорганическая химия. 2015. Т.41. № 5. С.559–564.
7.                Корниенко Е. И., Осмоловский А. А., Звонарева Е. С., Крейер В. Г., Шаркова Т. С., Егоров Н. С. // Успехи медицинской микологии. 2015. Т. 14. С. 434–436.
8.                Liu C., Matsushita Y., Shimizu K., Makimura K., Hasumi K. // Biochemical and Byophisical Research Communication. 2007. V.358. № 1. P. 356–362.
9.                Осмоловский А. А., Звонарева Е. С., Крейер В. Г., Баранова Н. А., Егоров Н. С.. Биоорганическая химия. 2014. Т. 40, № 6, с. 688–694.
10.            Бобровская А. А., Осмоловский А. А., Звонарева Е. С., Крейер В. Г., Кураков А. В. // Успехи медицинской микологии. 2015. Т. 14. С. 414–416.
11.            Осмоловский А. А., Крейер В. Г., Баранова Н. А., Кураков А. В., Егоров Н. С. // Прикладная биохимия и микробиология.2015. Т. 51. № 1. С. 86–92.