Бактериальные РНК-азы являются перспективными биотехнологическими основами для создания лечебных и профилактических противовирусных препаратов. В данной статье изучено влияние условий культивирования B. thuringiensis, рибонуклеазы которого обладают активностью подавлять размножение вирусов гриппа А/H3N2 и А/H5N1 на суммарный выход Рибонуклеаз.

Ключевые слова : Bacillus thuringiensis, РНК-азы, питательные среды, противовирусная активность, биотехнологическая перспектива.

На данный момент перед наукой стоят важные задачи, одной из которых является борьба с вирусными заболеваниями, в частности с вирусом гриппа и вирусом Covid-19. Вне зависимости от локальных успехов в борьбе с гриппозной и коронавирусной инфекцией, лечение данных инфекцией остается довольно сложной проблемой. Основная причина проблем с лечением и профилактикой данных инфекций, является высокая частота мутаций, краткий период сохранения иммунного ответа на данные инфекции, повышение антипрививочного движения, высокое распространение вируса. Все эти факторы ответственны за то что новые действующие препараты быстро теряют свою эффективность.

В связи с вышеперечисленными факторами, идет форсирование и расширение поиска тех биологически активных веществ, которые обладают противовирусным действием. Среди перечня данных веществ особый интерес занимает РНК-азы.

Рибонуклеазы (РНК-азы) — это ферменты — нуклеазы, отвечающие за деградацию Рибонуклеиновой кислоты (РНК). РНК-азы участвуют в основных процессах регуляции жизнедеятельности, к примеру, в репликации, транскрипции, трансляции, а особенно в процессинге, ведь невозможно созревание РНК без реакций деградации и именно поэтому эти ферменты выделяют как исполнители важнейшей биологической роли. Рибонуклеазы широко распространены в природе, данные ферменты присутствуют в животных, растениях, грибах, бактериях, а также в некоторых вирусах и бактериофагах. Выделяют экзо- и эндорибонуклеазы, а по механизму действия делят на фосфотрансферазы и фосфогидролазы. По месту нахождения наиболее яркий интерес вызывают РНК-азы, влияющие на клетку извне. Именно такие нуклеазы имеют потенциал применения в медицине не только в отношении противовирусной активности, но и как противоопухолевой. Можно выделить основные типы РНК-аз, обладающих противовирусной активностью.

Однако использование РНК-аз млекопитающих зачастую не эффективно, так как специфический ингибитор, находящийся во всех клетках и тканях и необходимый для защиты от собственных РНК-аз, блокирует активность РНК-аз. Но используя РНК-азы бактериального происхождения ингибитор действовать не будет. В связи с этим особый интерес проявляется к внеклеточным РНК-азам, секретируемые у бацилл, в том числе и у Bacillus thuringiensis . Так, к примеру, у эндорибонуклеазы бактерии видa B. intermedins зафиксирована эффективность против вируса гриппа А (H1N1).

Методы и материалы

Для проведения исследований были использованы бактерии вида B. thuringiensis , штамма В388 из коллекции бактерий и грибов АРУ им. К. Жубанова. Культивирование бактерий проводили на лизогенной среде LB и на среде КХПГ. Состав среды LB: триптон — 10,0 г/л; дрожжевой экстракт — 5,0 г/л; натрия хлорид — 5,0 г/л; бактериологический агар — 15,0 г/л;(bacto agar “Typ USA”, FERAK Berlin), pH среды 7,0 ± 0,2, состав среды КХПГ: Кормовые дрожжи (ВВК) — 15 г/л, хлористый кальций — 0,5 г/л, Пропинол Б400–1,0г/л, добавлением глицерин — 5,0, Na2HPO4–0,04, CaCl2–0,01, MgSO4×7H2O — 0,03. Суспензию бактериальных клеток вносили в количестве 1 % в колбы объемом 500 мл с 50 мл среды, инкубировали при t ^о — 28–30°С в течение 18–24 ч. при пассивной аэрации 6 ч.

Определение активности РНК-аз

В первую очередь центрифугировали пробы культурной жидности при 3000 об/мин в течение 1 ч., используя центрифуги модели «LCM 3000». Супернатант очищали, используя ацетатцеллюлозные фильтры, диаметром пор 0,45 мкм (ФМАЦ-0,45 мкм). Хранение осуществляли при температуре -20 ^о С, -25 ^о С.

Само определение активности РНК-аз определялось по количеству образующихся продуктов расщепления РНК дрожжей. За единицу активности фермента брали его количество, катализирующее образование 1 А ₂₆₀ продуктов в течение одного часа.

Сравнение роста Bacillus thuringiensis на среде LB и среде КХПГ

Используя две разные среды, мы наблюдали следующее: при одинаковых условиях культивирования, на разных средах, наблюдается разная морфология клеток.

В обеих средах бактерии находятся в вегетативном состоянии. Но на среде КХПГ, из-за добавления глицерина, хорошо заметны внутриклеточные запасные вакуоли с образованием выраженных для данных штаммов капсул. На среде LB капсулы менее выражены.

Активность РНК-аз в культурной жидкости

(Среда LB) (среда КХПГ)

Определение активности фермента Рибонкуклеазы у B . thuringiensis , штамма В388

Культивирование происходило на разных средах, но в одинаковых условиях. Из представленного графика видно, что в среде КХПГ , накопление фермента заняло более длительное время, однако максимальное число содержащегося фермента доходило до 385–400 е.а./ мл. в течение почти 60 часов. Однако в среде LB максимальное количество фермента было уже через 18–20 часов, но число максимального содержания отличилось на порядок — 40–43 е.а./мл. Также можем отметить, что на 18–20 ч. культивирования активность РНК-аз были сопоставимы.

Вывод

Стоит включить во внимание то что, бактерии рода Bacillus представляют огромный биотехнологический потенциал. В связи с этим целесообразно продолжать исследования Рибонуклеаз бацилл. Также можем отметить следующее, что РНК-азы B. thuringiensis исследованы недостаточно, но было показано, что внеклеточная РНК-аза B. thuringiensis, а точнее ее первичная структура, является гомологом Биназы (BS — РНКаза) .

В ранее проведенных исследованиях различных авторов было показано, что метаболиты B. thuringiensis способны подавлять размножения вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) на культуре ткани MDСK. Противовирусная активность препаратов, полученных на основе культуральной жидкости (КЖ) штаммов Bt, наряду с отсутствующей или незначительной токсичностью, считает перспективной дальнейшую их разработку в целях борьбы с вирусами гриппа человека и птиц.

Литература:

1. Прунтова О. В., Сахно О. Н., Мазиров М. А. Курс лекций по общей микробиологии и основам вирусологии/ Прунтова О. В., Сахно О. Н., Мазиров М. А./ Владимир — 2006 г., стр. 87–98, стр. 107–131
2. Cabrera-Fuentes H. A., Aslam M., Saffarzadeh M., Kolpakov A., Zelenikhin P., Preissner K. T., Ilinskaya O. N. 2013. Internalization of Bacillus intermedius ribonuclease (BINASE) induces human alveolar adenocarcinoma cell death. Toxicon., стр. 219–226.
3. Ильинская О. Н., Шах Махмуд М. Рибонуклеазы как противовирусные агенты // Молекуляр. биология. — 2014, № 5.- С. 707–717.