Возможности коррекции индуцированной иммуносупрессии с применением бактериального иммуномодулятора

Введение. Применение иммуномодулирующих препаратов является основной частью иммунореабилитации [1]. Они способствуют уменьшению токсических свойств лекарственных препаратов и лучшей их переносимости, снижению числа рецидивов и, таким образом, повышению качества жизни больных в связи с активацией клеток врожденного и приобретенного иммунитета, а также гуморальных факторов иммунной системы [2, 3]. Известно, что субпопуляционный состав лимфоцитов и структура лимфоидных органов могут служить характеристикой эффективности воздействия иммуномодулирующих препаратов. Использование результатов морфогистохимических исследований позволяет расширить представление об иммуномодулирующих эффектах, проявляющихся на уровне центральных и периферических органов иммунной системы и периферической крови. Подобные исследования, наряду с изучением макроскопических изменений и клинико-патологическими данными, способствуют установлению иммуномодулирующего эффекта того или иного препарата непосредственно на иммунную систему [4].

Цель исследования - изучение иммунофенотипа лимфоцитов селезенки и уровня сывороточных цитокинов, а также их спонтанной и индуцированной продукции мононуклеарными лейкоцитами селезенки на фоне индуцированной циклофосфаном иммуносупрессии при воздействии иммуномодулятора вакцины Иммуновак.

Материалы и методы. Мышам линии СВА вводили циклофосфан (ЦФ) по 100 мг/кг массы тела внутрибрюшинно 4-кратно с интервалом 24 часа. Спустя сутки внутрибрюшинно однократно вводили 200 мкг вакцины Иммуновак, которая является поликомпонентным препаратом из антигенов условно-патогенных микроорганизмов (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) и содержит липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны грамотрицательных микроорганизмов, пептидогликан, тейхоевые кислоты и лабильные белковые компоненты стафилококка. Через 4, 24 и 96 часов после введения вакцины у мышей под эфирным наркозом извлекали селезенку и пробы периферической крови. Спленоциты получали после гомогенизирования селезенок и центрифугирования клеточной взвеси в градиенте плотности фиколл-урогафин (1,077 г/см3). Уровень цитокинов в пробах (сыворотка, культуральная жидкость) определяли методом твёрдофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем (Biosource, Бельгия) согласно инструкции производителя. С целью определения цитокинов в супернатанте культуры спленоцитов к мононуклеарным лейкоцитам (МЛ) селезенок добавляли фитогемагглютинин – ФГА в оптимальной концентрации - 5 мкг/мл. Клетки инкубировали в течение 48 часов при температуре +37^оС и концентрации СО₂ 4,5%. Статистическая обработка данных проводилась с использованием t-критерия Стъюдента при помощи пакета статистических программ Windows 2003 (StatSoft 6.0).

Основные результаты. В ходе проведенных исследований установлено, что спонтанная продукция провоспалительных цитокинов селезёночными МЛ после воздействия ЦФ снижалась через 4 часа - для IL-6 и TNF-α (с 60,7±5,8 до 31,5±4,6 и с 44,9±3,3 до 14,2±2,8 пкг/мл соответственно; p<0,05) и через 24 часа — для IL-1β (со 100,4±9,6 до 26,8±4,1 пкг/мл). Концентрация противовоспалительных и регуляторных цитокинов IL-4, IL-10, TGF-β фактически не отличалась от фоновой. Введение интактным животным Иммуновак сопровождалось существенным увеличением спонтанной продукции провоспалительных цитокинов, при этом максимальные концентрации (пкг/мл) определялись через 4 часа после инъекции: IL-1β – 387,8 (со 100,4±9,6), TNF-α – 173,2±9,8 (с 44,7±6,1) и IL-6 – 170,5±14,6 (с 60,5±4,2); (p<0,05). Из противовоспалительных цитокинов вакцина Иммуновак существенно увеличивала спонтанную продукцию только TGF-β, содержание которого через 24 часа после инъекции повышалось с 69,8±5,4 до 231,5±10,6 пкг/мл (p<0,05). Комбинация ЦФ и Иммуновак вызывала сходную с действием вакцины в монорежиме, но менее выраженную динамику продукции как в отношении провоспалитетельных, так и противовоспалительных цитокинов. Значительные изменения концентрации цитокинов в данном эксперименте были обнаружены при изучении индуцированой ФГА продукции рассматриваемых биорегуляторов. В частности, провоспалительные цитокины IL-1β, IL-6 и TNF-α достигали минимальных значений через 4 часа после курса введения цитостатика - с 470,9±16,8 до 88,5±4,9; с 384,1±6,7 до 212,3±4,5; с 233,7±13,9 до 66,4±9,1 пкг/мл соответственно (p<0,05). Существенное снижение их продукции отмечалось в течение 24-х часов. Значительно снижалось количество и противовоспалительных цитокинов: IL-4 - с 133,8±14,1 до10,7±2,2; IL-10 - с 50,9±6,3 до 10,4±3,2 пкг/мл (p<0,05). Минимальная концентрация IL-4 наблюдалась через 4, а IL-10 - через 24 часа. Уменьшалась и продукция TGF-β - c 138,6±9,1 до 111,4±10,2 пкг/мл (p<0,05). Вакцина Иммуновак при воздействии ФГА вызывала значительное усиление секреции провоспалительных цитокинов с пиком концентрации через 4 часа после введения: IL-1β - с 470,9±16,8 до 1766,8±93,5; IL-6 - с 384,3±15,8 до 668,9±21,9 и TNF-α - с 233,7±19,6 до 492,3±11,2 пкг/мл (p<0,05). Среди противовоспалительных цитокинов через 96 часов после инъекции в наибольшей степени увеличилась продукция IL-10 - с 50,9±6,3 до 143,8±12,6 пкг/мл (p<0,05). В данных условиях высвобождение TGF-β повышалось только через 4 часа после введения иммуномодулятора, в то время как уровень продукции IL-4 не отличался от показателей контрольной группы. Комбинированное воздействие ЦФ и Иммуновак нивелировало отрицательную динамику индуцированной продукции цитокинов, вызванную введением только одного цитостатика. Следует отметить, что при этом концентрация TNF-α через 4 часа после введения препаратов была выше, чем у интактных животных (исходная - 233,6±8,4 максимальная - 393,5±6,7 пкг/мл). Противовоспалительные цитокины достигали или незначительно превышали фоновый уровень данных медиаторов. Показано, что Иммуновак вызывает максимальное увеличение продукции провоспалительных цитокинов в более ранние сроки (через 4 часа), чем противоспалительных (через 24-96 часов). Показатели продукции сывороточных цитокинов оказались менее информативными для оценки супрессивного действия ЦФ, поскольку их исходные значения имели низкий уровень и не позволяли определить снижение их концентрации. Вместе с тем, при действии Иммуновак отмечалось увеличение содержания про- и противовоспалительных цитокинов через 4 и 24 часа соответственно и аналогичная тенденция была отмечена при действии вакцины на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии. Анализ иммунофенотипа спленоцитов экспериментальных мышей продемонстрировал заметное снижение количества основных субпопуляций лимфоцитов под действием циклофосфана по сравнению с контрольной группой. В частности, на вторые сутки после последнего введения циклофосфана регистрируется уменьшение доли В-лимфоцитов (CD19+) в 3 раза (p<0,05). Среди Т-клеток в наибольшей степени супрессивное действие циклофосфана оказало влияние на CD4+-лимфоциты, содержание которых снизилось почти в 2,5 раза по сравнению с контролем (p<0,05). Введение циклофосфана приводит к достоверному снижению числа натуральных киллеров (DX5+) с 12±2% до 3±0,1% (p<0,01). Наряду с перечисленными данными, наблюдается также очевидная тенденция к понижению уровня НКТ (CD3+/ DX5+) и Т-регуляторных клеток (CD4+/ CD25+). В меньшей степени были подвержены действию циклофосфана CD8+-лимфоциты. Восстановление исходных показателей иммунофенотипа в данных условиях регистрировалось на 5-7 сутки после последнего введения цитостатика. Воздействие Иммуновак приводило к нормализации, вызванных цитостатиком основных нарушений иммунного статуса. Так в группе мышей, получавших Иммуновак после введения циклофосфана, уже на 2-е сутки содержание CD19+ -клеток почти приближалось к их количеству у интактных животных и составляло 19±5%, а число CD4+-лимфоцитов поднялось с 17±3 до 28±9%.

Заключение. Для коррекции нарушения иммунного статуса, обусловленного супрессивным действием цитостатиков, могут быть использованы иммуномодуляторы бактериального происхождения отечественного производства, в частности, вакцина Иммуновак.

Литература

1. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение// Иммунология. – 2003. – Т.24. — № 4. – С. 196-203.

2. Ахматова Н.К., Киселевский М.В., Курбатова Е.А., Егорова Н.Б., Семенов Б.Ф. Иммуномодулятор Иммуновак-ВП-4 уменьшает иммуносупрессию и усиливает цитотоксическую активность цитостатика цисплатина// Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии – 2005. – №2. – С.44-48.

3. Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Бактериальные иммуномодуляторы// Русский медицинский журнал. – 2001. – Т.9. — №16-17. – С. 703-705.

4. Vinod G., Arun P., Santanu J. Lymphoid tissue in toxicity studies: An over view // Journal of immunology and immunopathology. — 2009. — V.11, issue 2. — P.125-138.