Повышение биологической совместимости традиционного никелид-титанового сплава и оценка его токсичности на культурах мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека в эксперименте

Особое место в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии занимают пористые изделия, позволившие решить многие проблемы при замещении дефектов костной ткани. Для пористых материалов медицинского назначения первостепенное значение имеют биохимическая совместимость с тканями организма. Биосовместимость определяется, в первую очередь, фазовым составом материала. Никелид титана, полученный методом самораспространяюшегося высокотемпературного синтеза (СВС), характеризуется фазовой неоднородностью – наряду с основной фазой TiNi в значительном количестве присутствуют вторичные фазы Ti₂Ni и TiNi₃ [Ходоренко В.Н., 2001]. Вопрос о влиянии вторичных фаз на биохимические свойства никелида титана остается открытым. Установлено, что наличие фазы Ti₂Ni повышает электрохимическую коррозию имплантатов из литого никелида титана и, соответственно, может отрицательно влиять на их биосовместимость [Ильин А.А., 2007]. Однако экспериментальные и клинические исследования, выполненные В.Э. Гюнтером, не выявили негативного влияния вторичных фаз на биосовместимость СВС-никелида титана. Вместе с тем следует отметить, что фазовый состав оказывает сильное влияние на характеристическую температуру мартенситных превращений и параметры памяти формы. Изменение содержания компонентов на сотые доли процента ведут к сдвигу температуры фазовых превращений в материалах на основе никелида титана на десятки градусов [Ходоренко В.Н., 2001]. Поэтому в системе Ti-Ni желательно иметь только основную фазу TiNi и стабильные физико-механические свойства и параметры памяти формы. Содержание вторичных фаз в СВС-никелиде титана можно уменьшить за счет увеличения температуры синтеза в зоне фазообразования. С этой целью использовался предварительный нагрев исходной шихты внешним нагревателем [Ясенчук Ю.Ф., 2002]. Установлено, что при начальной температуре шихты 500 °С обогащенных никелем вторичных фаз (фаза TiNi₃) практически не наблюдается. Увеличение начальной температуры шихты до 600 °С и выше приводит к повышению температуры в зоне фазообразования настолько, что из-за чрезмерного содержания жидкой фазы конечный продукт в поле сил тяжести теряет свою структурную устойчивость и происходит усадка и уменьшение пористости. Таким образом, предварительный нагрев исходной шихты внешним нагревателем не обеспечивает получение однофазного СВС-никелида титана из смеси порошков титана и никеля.

В этой связи для увеличения температуры синтеза предлагается использовать не внешний, а внутренний источник тепла в виде добавки в исходную шихту высокоэкзотермических реагентов. При этом продукты реакции добавляемых компонентов должны иметь биосовместимость с тканями организма и более высокую температуру плавления, чем соединения титана с никелем. Тогда силами поверхностного натяжения жидкой фазы частицы тугоплавкой фазы будут стягиваться в твердожидкий каркас, сохраняющий свою форму в поле сил тяжести. Указанным требованиям в полной мере отвечает нестехиометрический карбид титана TiC_0,5. Температура горения при синтезе карбида TiC_0,5 составляет 2500 °С, а температура горения при синтезе никелида титана с нагревом исходной шихты Ti-Ni до температуры 500 °С не превышает 1650 °С. Температура плавления карбида TiC_0,5, которая равна Т_пл ≈ 2500 °С, также намного выше, чем температура плавления наиболее тугоплавкой фазы TiNi₃, у которой Т_пл = 1380 °С.

Цель настоящей работы – повысить биологическую совместимость традиционного никелид титанового сплава и изучить его токсичность на культурах мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток костного мозга человека.

Материалы и методы

При составлении экзотермических шихт использовались порошки следующих марок: титан ПТС; углерод технический (сажа) П804Т и никель ПНЭ-1. Шихтовая смесь готовилась из расчета образования двухфазного продукта состава TiC_0,5 – 25% (мас.) TiNi. Дозировка компонентов шихты осуществлялась с точностью 0,1 г. Приготовление экзотермической шихты массой 0,2 кг заданного состава производилось в шаровой мельнице объемом 1 л при соотношении масс шаров и шихты 3:1. Время смешивания составляло 4 часа. С целью повышения порообразования в шихту добавляли 2% (мас.) пищевого крахмала. Синтез проводили при комнатной температуре в газопроницаемой оболочке из речного песка. Микроструктурный анализ осуществляли на растровом электронном микроскопе Jeol JSM-6390A. Состав продуктов синтеза определяли методом рентгенофазового анализ. Съемка рентгеновских спектров проводили на дифрактометре ARL X′TRA. Для тестирования на токсичность, СВС-материал отмывали путем пятикратного погружения в 50 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (Sigma), высушивали, стерилизовали в автоклаве при температуре 121&#;С, 2,1 атм., в течении 20 минут. В работе были использованы мультипотентные мезинхимальные стромальные клетки 2 пассажа со следующим фенотипом: позитивны на CD73, CD90, CD105, CD44 и негативны CD14, CD34, HLA-DR. Клетки культивировали в стандартных условиях в инкубаторе SANYO MCO-20AV в режиме 37 °С, 5% СО в культуральных флаконах (NUNC), площадью 175 см². Тестирование проводилось в культуральных 24 луночных планшетах (NUNC) на среде A-MEM (Sigma), с 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone), 2mM L- аланин-глутамина (Invitrogen). Опыт осуществляли методами прямого контакта и эксплантатов – мезинхимальных клеток. Исследуемый материал помещали в лунки 24 луночного планшета (NUNC) с культуральной средой, куда, через 10 минут помещали клетки (100.000 клеток на лунку) из культурального флакона. Морфология оценивалась при помощи инвертированного микроскопа проходящего света с системой видеонаблюдения «Сarl ZEISS Observer. A1» и электронного микроскопа JEOL JSM-63909A. Контролем эксперимента служили: 1) секции с питательной средой и образцами материала в которые не высеивали мезинхимальные клетки, 2) секции с культурами мезинхимальных клеток, которые пассировали и наблюдали одновременно с экспериментальными, не помещая материал.

Результаты эксперимента

Матрица материала имеет гладкую оплавленную поверхность, размер пор составляет 100 ÷ 400 мкм, пористость - около 50 % . Результаты рентгенофазового анализа показали, что продукты синтеза состоят только из двух фаз: нестехиометрического карбида титана TiC_0,62 и стехиометрического никелида титана TiNi. Таким образом, увеличение температуры синтеза за счет тепла реакции образования карбида титана TiC_0,62 позволило предотвратить образование вторичных фаз. В условиях культивирования мультипотентных мезинхимальных стромальных клеток человека с образцами во всех случаях наблюдалось визуальное увеличение количества клеток, что не отличалось от роста в контрольной группе. Данные световой микроскопии показывали, что с 1 по 4-е сутки клетки распластывались на поверхности образцов. При ежедневном наблюдении был отмечен нормальный рост культур в рабочей группе, характерный для фибробластоподобных клеток, по характеру роста и размеру не отличающихся от таковых в контрольной группе. На 5-8-е сутки во всех ислледуемых образцах клетки достигли 80% монослоя на поверхности пластика. В исследуемых и контрольных группах были обнаружены первые единичные клетки в порах материала, которые находились в их просвете, фиксируясь к стенкам. С 9-е по 18-е сутки наблюдалась положительная динамика увеличения количества клеток в просвете пор. Во всех группах мезинхимальные клетки сохраняли характерную морфологию, при световой микроскопии во всех порах, доступных визуальному осмотру, наблюдали большие скопления клеток. С 18 по 30-е. сутки визуальная картина вокруг материала и на его поверхности, при световой микроскопии, не изменялась. На 9 день 2 образца материла – 1 контрольный и 1 рабочий были изъяты из культуральной посуды, двукратно отмыты в PBS, затем помещены в новую культуральную посуду с питательной средой без клеток для проведения тестирования методом «экспланта». На 12 сутки в рабочей группе были обнаружены первые клетки, прикрепившиеся к поверхности пластика непосредственно возле материала. В контрольной группе клеток обнаружено не было. На 15-17 сутки в рабочей группе наблюдались значительное количество мигрировавших клеток с поверхности материала. К 21 суткам клетки образовали крупные колонии. В группе контрольного материала на протяжении всего исследования клеток обнаружено не было.

Выводы

В ходе проведённого эксперимента, мы не смогли обнаружить признаки какого либо негативного воздействия нового СВС-материала TiC_0,5 – TiNi на клетки. Морфология клеток, скорость пролиферации, плотность межклеточных контактов оставалась аналогичной клеткам в контрольной группе. Такие наблюдения позволяют нам сделать вывод об абсолютной индифферентности СВС-материала TiC_0,5 – TiNi со сквозной пористостью, отсутствие его токсичности к культурам мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток, хорошие адгезивные свойства клеток к поверхности материала и пролиферативную активность. Произведённые исследования позволяют рекомендовать данный материал к внедрению в клиническую практику в качестве материала для изготовления имплантатов.