Опыт использования Полиоксидония для стимуляции специфического иммунного ответа при экспериментальной хантавирусной инфекции in vivo | Статья в журнале «Молодой ученый»

Библиографическое описание:

Потт А. Б., Иунихина О. В., Компанец Г. Г. Опыт использования Полиоксидония для стимуляции специфического иммунного ответа при экспериментальной хантавирусной инфекции in vivo // Молодой ученый. — 2015. — №1. — С. 132-135. — URL https://moluch.ru/archive/81/14589/ (дата обращения: 17.10.2018).

Введение

Хантавирусы (род Hantavirus, семейство Bunyaviridae), как и некоторые другие вирусы — возбудители зоонозов, вызывают у природных хозяев — грызунов и насекомоядных бессимптомную хроническую персистентную инфекцию [1]. У людей некоторые типы хантавирусов вызывают такие тяжелые заболевания, как геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) и хантавирусный кардиолегочный синдром (ХКЛС). Отсутствие в настоящее время эффективной специфической противовирусной терапии делает крайне необходимым постоянный поиск новых, специфических и не специфических противовирусных средств, а также профилактических средств, способных помочь организму человека справиться с тяжелой и, в ряде случаев, летальной инфекцией. Ранее, на модели хантавирусной инфекции in vitro показано противовирусное действие биологически-активных молекул сульфатированных полисахаридов из морских гидробионтов [2, 3].

Полиоксидоний (ПО) — это первый в мире химически чистый высокомолекулярный иммуномодулятор, N-оксидированное производное полиэтиленпиперазина, созданный отечественными ученными Петровым Р. В., Хаитовым Р. М., Некрасовым А. В. и др. ПО является уникальной полимерной молекулой с многогранным положительным воздействием на организм человека, которое заключается в следующих эффектах: иммуностимулирующем, детоксицирующем, антиоксидантном, мембраностабилизирующем [4]. ПО разрешен к медицинскому применению у детей и взрослых в дозе 0,1 мг/кг в двух лекарственных формах: инъекционной и в виде суппозиториев и входит в реестр ЖНВЛС (распоряжение Правительства РФ от 29 марта 2007 г. № 376-р).

Цель работы состояла в изучении влияния иммуномодулятора Полиоксидоний на гуморальный иммунный ответ у мышей при экспериментальной хантавирусной инфекции.

Материалы и методы

Штамм хантавируса. Для иммунизации лабораторных животных использовали штамм хантавируса Аа 60343 79–95 (ПМ-95) из рабочей коллекции лаборатории хантавирусных инфекций ФГБУ «НИИЭМ имени Г. П. Сомова», обладающий значительной высокой вирулентностью для сосунков белых лабораторных мышей и иммуногенностью [5]. В эксперименте использовали вируссодержащий супернатант, полученный при инфицировании линии клеток Vero E-6 вышеуказанным штаммом хантавируса. Титр вируса для иммунизации составлял не менее 5,0 lg ФОЕ/1,0 мл.

Препарат. В качестве иммуномодулятора выбран коммерческий препарат с торговым названием Полиоксидоний® (ООО «НПО Петровакс Фарм»). Регистрационный номер: Р N002935/02. Международное непатентованное название: Азоксимера бромид. Сополимер N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиний бромида. Препарат в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций и местного применения, дозировка 1,0 г (3 мг АФИ). Фармакотерапевтическая группа: иммуномодулирующее средство. Код АТХ: [L0З]

Доза Полиоксидония подбиралась экспериментальным путем, на массу тела, как это проводилось для дозирования препарата у людей (обычная дозировка — 6 мг/среднюю массу тела человека 63 кг). Учитывая, что в возрасте 3–4 недели средняя масса тела белой крысы составляет примерно 80–100 г, средняя доза/крысу составила примерно 8,6 мкг/крысу. Концентрация полиоксидония в исходном растворе составила 3 мг/мл, для иммунизации использовали рабочий раствор полиоксидония — 30 мкг/мл.

Животные. В эксперименте использовали самцов белых лабораторных крыс Wistar в возрасте 3–4 недели, средняя масса 80–100 г (n= 42). Животных содержали в стандартных условиях вивария: в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой, не более 5 особей в клетке, стандартный рацион и питьевой режим в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР от 10 марта 1966 г. № 163 и приказом Минздрава СССР от 10.10.83 № 1179 (пункт 4.1). Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. Уход за инфицированными животными и работу с ними осуществляли в условиях вивария с уровнем безопасности Р-3 (BSL-3).

Схема иммунизации. Животные были разделены на 2 экспериментальные группы: в I контрольной группе животные получали внутримышечно однократно инъекции вируссодержащей жидкости (0,1 мл, 0,2 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл); во II группе однократно в левую заднюю лапку внутримышечно вводили вируссодержащую жидкость (0,1 мл, 0,2 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 05 мл) и в правую — раствор Полиоксидония в дозе 0,28 мл (8,6 мкг). Для уменьшения болевых ощущений, возникающих у животных при внутримышечном введении препаратов, рабочее разведение полиоксидония готовили на 0,5 % растворе новокаина, учитывая его анестезирующее действие и отсутствие лекарственного взаимодействия с Полиоксидонием. На 35–40 день после заражения животных обескровливали под общим наркозом и исследовали образцы крови на наличие специфических антител.

Непрямой метод флюоресцирующих антител (НМФА). Для выявления титра специфических антител в сыворотках крови экспериментально инфицированных животных использовали НМФА, постановка которого осуществлялась согласно методическим рекомендациям [6].

Определение авидности антител проводили согласно прописанной методике K. Hedman с соавторами (1991) [7].

Реакция нейтрализации (РН) проводилась для обнаружения антихантавирусных нейтрализующих антител. Реакция основана на методе выявления фокусобразующих единиц (ФОЕ) в культуре клеток под полужидким покрытием (0,6 % карбоксиметилцеллюлозы) [8].

В тексте показатели титра антител представлены в обратных величинах (т. е. при получении титра антител 1:128, расчет проводился исходя из величины 128).

Все полученные данные статистически обрабатывались при помощи программы «BIOSTAT».

Результаты и обсуждения

В первой (контрольной) группе животные получали только инъекции вируссодержащей жидкости (0,1 мл, 0,2 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл). Первичную оценку зависимости величины титра антител от введенной дозы вируса проводили в НМФА. Показано, что у отдельных животных в первой и четвертой группах выявлены максимальные значения титра антител — 256, минимальный титр 32 выявлен у животных во второй группе. Средний титр антител у животных первой группы составил — 176, во второй — 74,67, в третьей — 80, в четвертой — 149,3 и в пятой — 96. Таким образом, при первичном анализе средних показателей не выявлено линейной прямо пропорциональной зависимости величины титра антител от введенной дозы вируса. Однако анализ тенденции показал линейную зависимость средней величины титра антител в НМФА от дозы вируса. То есть, максимальная доза вируса приводила к большей стимуляции процесс антителообразования.

Для того, чтобы доказать иммуностимулирующие характеристики полиоксидония во второй (экспериментальной) группе мышам вводили вирус (в тех же дозах, что и в первой группе) и иммуномодулятор Полиоксидоний. В НМФА у первой группы животных средний титр АТ составил 1024, во второй группе — 819,2, в третьей группе — 614,4, в четвертой и пятой группах средний титр составил — 409,6.

Сравнение результатов средних титров в НМФА в контрольной и экспериментальной группах показало значимую разницу в средних титрах: при введении полиоксидония, средние титры были выше в 5,8 раза, 10,97 раза, 7,7 раз, 2,7 раза и 4,2 раза в группах с 1 по 5 соответственно. Во второй группе также прослеживалась линейная зависимость средней величины титра антител от введенной дозы вируса, что подтверждено анализом тенденции. Следует отметить, что интенсивность иммунного ответа была выше в группах животных, получивших более высокие дозы вируса.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что введение полиоксидония статистически достоверно стимулировало антителообразование при всех дозах вируса (рис.1).

Рис. 1. Зависимость среднего титра антител от дозы хантавируса (без введения полиоксидония и при одновременном введении вируса и полиоксидония) в двух группах. Примечание: по оси ординат — обратные значения титра антител в сыворотке крови животных НМФА; по оси абсцисс — доза вируссодержащей жидкости (мл), использованная для иммунизации животных; р — доверительная вероятность (по коэффициенту Стьюдента)

 

Во всех исследованный сыворотках крови экспериментальных животных выявлены антитела высокой авидности, что дополнительно свидетельствует о эффективности противовирусного иммунитета.

Специфичность иммунного ответа изучали при анализе нейтрализующих антител (нАТ) (реакция нейтрализации). В контрольной группе максимальный титр нАТ выявлен у животных в 1 группе — 384 (доза вируса — 0,5 мл), минимальный титр в 4 и 5 группах (доза вируса 0,2 мл и 0,1 мл соответственно). Средний титр составил — 208, 122,7, 108, 160 и 176 в 1,2,3, 4 и 5 группах соответственно. Как и в НМФА, при первичном анализе результатов реакции нейтрализации четкая линейная прямо пропорциональная зависимость величины титра антител от введенной дозы вируса не прослеживалась. Но анализ тенденции показал линейную зависимость средней величины титра антител в РН от дозы вируса, вводимой лабораторным животным.

Таким образом, результаты изучения иммуногенности штамма ПМ-95 свидетельствуют, что даже минимальная исследованная доза вируса приводила к значительной стимуляции полноценного нейтрализующего вирус иммунного ответа.

Сравнение результатов средних титров в РН в экспериментальной группе животных, получавших Полиоксидоний, с контрольной группой показало значимую разницу в средних титрах при введении полиоксидония, средние титры были выше в 5,8 раза, 10,97 раза, 7,7 раз, 2,7 раза и 4,2 раза в группах с 1 по 5 соответственно.

Как и в НМФА отмечена явная зависимость увеличения антителообразования при повышении дозы вируса. При сравнении между группами, получавшими одинаковую дозу вируса вместе с препаратом или без него, отмечено, что титр антител после введение Полиоксидония был статистически достоверно выше (рис.2).

Рис. 2. Зависимость среднего титра антител от дозы вируса (без введения полиоксидония и при одновременном введении вируса и полиоксидония) в двух группах. Примечание: по оси ординат — обратные значения титра антител в сыворотке крови животных РН; по оси абсцисс — доза вируссодержащей жидкости (мл), использованная для иммунизации животных; р — доверительная вероятность (по коэффициенту Стьюдента)

 

Выводы

1.      Установлено, что применение препарата Полиоксидоний приводит к стимуляции выработки специфических антител в крови экспериментальных животных при введении разных доз хантавируса.

2.      Показано, что стимулирующее действие препарата Полиоксидоний проявляется в значительном увеличении выработки специфических антител в крови экспериментальных животных даже при наименьшей антигенной нагрузке.

3.      Использование препарата Полиоксидоний вызывает формирование антител, обладающих вируснейтрализующей активностью в крови экспериментальных животных.

4.      Титр специфических антител при введении Полиоксидония был статистически достоверно выше, чем титр антител при введении любых исследованных доз хантавируса.

 

Литература:

 

1.      Schmaljohn C., Hjelle B. Hantaviruses: a global disease problem // Emerging Infectious Diseases. — 1997. — Vol. 3, № 2. — P. 95–104.

2.      Макаренкова И. Д., Компанец Г. Г., Беседнова Н. Н., Слонова Р. А. Скрининг биополимеров из морских гидробионтов, влияющих на адсорбцию вируса Хантаан // Вопр. вирусол. — 2007. — № 2. — С. 29–32.

3.      Максема И. Г., Компанец Г. Г., Барабанова А. О., Ермак И. М., Слонова Р. А.. Противовирусное действие каррагинанов из красной водоросли при экспериментальной хантавирусной инфекции // Тихоок. мед.журн., 2012, № 1. С. 32–34.

4.      Хаитов Р. В., Пинегин Б. В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. — 1996. — № 8. — С. 7–12.

5.      Компанец Г. Г. Биологические свойства хантавирусов, циркулирующих в Приморском крае // Тихоокеанский медицинский журнал. — 2008. — № 2. — С. 61–64.

6.      Методы лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом. — М., 1982.

7.      Hedman K., Vaheri A., Brummer-Korvenkontio M. Rapid diagnosis of hantavirus disease with an IgG-avidity assay // The Lancet. — 1991. — Vol. 338, № 8779. — P.1353–1356.

8.      Дзагурова Т. К., Ткаченко Е. А., Башкирцев В. Н., Окулова Н. М., Апекина Н. С. и др. Выделение и идентификация штаммов хантавирусов-возбудителей ГЛПС в европейской части России // Медицинская вирусология. — 2008. — Т. XXV. — С. 142–50.

Основные термины (генерируются автоматически): группа, животное, доза вируса, введенная доза вируса, линейная зависимость, контрольная группа, иммунный ответ, анализ тенденции, величина титра антител, титр антител.


Похожие статьи

Проблемы диагностики, лечения вирусного иммунодефицита...

Ключевые слова: вирус иммунодефицита кошек, инфекция, T-лимфоциты, диагностика, статистический анализ, кошки.

Механизмом исследования являются титры антител в сыворотке, плазме или антикоагулированной крови.

Иммуногематологические критерии оценки иммунного ответа...

Хорошо видно, что в контрольной группе животных (не иммунизированных ЭБ) изменения

0,2. При этом величина ИМЛ прямо коррелирует как с числом РОК селезенки (r=0,83), так и титрами антител (r=0,88), а значения ГИ — отрицательно (r = -0,78 и r = -0,68 соответственно).

Оценка длительности и напряженности поствакцинального...

Титры антител снижаются быстрее у лиц, вакцинированных в возрасте до 4 лет.»

При отрицательном результате ввести вторую бустерную дозу вакцины.

Исаев Н.В. Состояние и тенденции развития эпидемического процесса гепатитов В и С в Перми.

Влияние минерального и масляного адъювантов на...

Титр специфических антитоксических антител всыворотке крови крыс после иммунизации. Группа животных ипрепарат. Количество антител по дням после вакцинации.

Тканевой препарат «Бурсанатал». Его влияние на резистентность...

Напряженность иммунитета при этом сохраняется на весь период наблюдения на уровне 47,4–66,9 %, тогда как в контрольной группе титры антител снижаются в 2,8 раза. При болезни Ньюкасла титр антител в опытной группе составил 6,7ед...

Особенности иммунологических изменений у женщин...

У женщин второй группы эти антитела встречались в 23,4±2,9 % (P<0,001), в этой группе высокие титры антител к тиреоглобулину встречались у 8,6 % обследованных.

Проблемы диагностики, лечения вирусного иммунодефицита...

Ключевые слова: вирус иммунодефицита кошек, инфекция, T-лимфоциты, диагностика, статистический анализ, кошки.

Механизмом исследования являются титры антител в сыворотке, плазме или антикоагулированной крови.

Иммуногематологические критерии оценки иммунного ответа...

Хорошо видно, что в контрольной группе животных (не иммунизированных ЭБ) изменения

0,2. При этом величина ИМЛ прямо коррелирует как с числом РОК селезенки (r=0,83), так и титрами антител (r=0,88), а значения ГИ — отрицательно (r = -0,78 и r = -0,68 соответственно).

Оценка длительности и напряженности поствакцинального...

Титры антител снижаются быстрее у лиц, вакцинированных в возрасте до 4 лет.»

При отрицательном результате ввести вторую бустерную дозу вакцины.

Исаев Н.В. Состояние и тенденции развития эпидемического процесса гепатитов В и С в Перми.

Влияние минерального и масляного адъювантов на...

Титр специфических антитоксических антител всыворотке крови крыс после иммунизации. Группа животных ипрепарат. Количество антител по дням после вакцинации.

Тканевой препарат «Бурсанатал». Его влияние на резистентность...

Напряженность иммунитета при этом сохраняется на весь период наблюдения на уровне 47,4–66,9 %, тогда как в контрольной группе титры антител снижаются в 2,8 раза. При болезни Ньюкасла титр антител в опытной группе составил 6,7ед...

Особенности иммунологических изменений у женщин...

У женщин второй группы эти антитела встречались в 23,4±2,9 % (P<0,001), в этой группе высокие титры антител к тиреоглобулину встречались у 8,6 % обследованных.

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle

Похожие статьи

Проблемы диагностики, лечения вирусного иммунодефицита...

Ключевые слова: вирус иммунодефицита кошек, инфекция, T-лимфоциты, диагностика, статистический анализ, кошки.

Механизмом исследования являются титры антител в сыворотке, плазме или антикоагулированной крови.

Иммуногематологические критерии оценки иммунного ответа...

Хорошо видно, что в контрольной группе животных (не иммунизированных ЭБ) изменения

0,2. При этом величина ИМЛ прямо коррелирует как с числом РОК селезенки (r=0,83), так и титрами антител (r=0,88), а значения ГИ — отрицательно (r = -0,78 и r = -0,68 соответственно).

Оценка длительности и напряженности поствакцинального...

Титры антител снижаются быстрее у лиц, вакцинированных в возрасте до 4 лет.»

При отрицательном результате ввести вторую бустерную дозу вакцины.

Исаев Н.В. Состояние и тенденции развития эпидемического процесса гепатитов В и С в Перми.

Влияние минерального и масляного адъювантов на...

Титр специфических антитоксических антител всыворотке крови крыс после иммунизации. Группа животных ипрепарат. Количество антител по дням после вакцинации.

Тканевой препарат «Бурсанатал». Его влияние на резистентность...

Напряженность иммунитета при этом сохраняется на весь период наблюдения на уровне 47,4–66,9 %, тогда как в контрольной группе титры антител снижаются в 2,8 раза. При болезни Ньюкасла титр антител в опытной группе составил 6,7ед...

Особенности иммунологических изменений у женщин...

У женщин второй группы эти антитела встречались в 23,4±2,9 % (P<0,001), в этой группе высокие титры антител к тиреоглобулину встречались у 8,6 % обследованных.

Проблемы диагностики, лечения вирусного иммунодефицита...

Ключевые слова: вирус иммунодефицита кошек, инфекция, T-лимфоциты, диагностика, статистический анализ, кошки.

Механизмом исследования являются титры антител в сыворотке, плазме или антикоагулированной крови.

Иммуногематологические критерии оценки иммунного ответа...

Хорошо видно, что в контрольной группе животных (не иммунизированных ЭБ) изменения

0,2. При этом величина ИМЛ прямо коррелирует как с числом РОК селезенки (r=0,83), так и титрами антител (r=0,88), а значения ГИ — отрицательно (r = -0,78 и r = -0,68 соответственно).

Оценка длительности и напряженности поствакцинального...

Титры антител снижаются быстрее у лиц, вакцинированных в возрасте до 4 лет.»

При отрицательном результате ввести вторую бустерную дозу вакцины.

Исаев Н.В. Состояние и тенденции развития эпидемического процесса гепатитов В и С в Перми.

Влияние минерального и масляного адъювантов на...

Титр специфических антитоксических антител всыворотке крови крыс после иммунизации. Группа животных ипрепарат. Количество антител по дням после вакцинации.

Тканевой препарат «Бурсанатал». Его влияние на резистентность...

Напряженность иммунитета при этом сохраняется на весь период наблюдения на уровне 47,4–66,9 %, тогда как в контрольной группе титры антител снижаются в 2,8 раза. При болезни Ньюкасла титр антител в опытной группе составил 6,7ед...

Особенности иммунологических изменений у женщин...

У женщин второй группы эти антитела встречались в 23,4±2,9 % (P<0,001), в этой группе высокие титры антител к тиреоглобулину встречались у 8,6 % обследованных.

Задать вопрос