Авторы: Холамов Алексей Игоревич, Мирзомогомедова Виктория Геннадьевна

Рубрика: Медицина

Опубликовано в Молодой учёный №9 (68) июнь-2 2014 г.

Дата публикации: 17.06.2014

Статья просмотрена: 250 раз

Библиографическое описание:

Холамов А. И., Мирзомогомедова В. Г. Повышение цитотоксичности естественных киллеров крови пациентов, страдающих туберкулезом легких, с помощью препарата «Реамберин»© // Молодой ученый. — 2014. — №9. — С. 62-65.

Естественные киллеры (ЕК) являются клетками врожденного иммунитета, отвечающими за противоопухолевый и противовирусный иммунитет. В ходе некоторых экспериментов отмечалось увеличение количества ЕК в легочных альвеолах мышей на ранних стадиях инфицирования M. tuberculosis. Повышение цитотоксичности ЕК с помощью модификаторов биологических реакций является одним из приоритетных направлений в иммунологии. Успехи в данной области позволят в перспективе снизить заболеваемость туберкулезом легких благодаря увеличению их цитотоксичности.

Ключевые слова: мононуклеары периферической крови, естественные киллеры, туберкулез легких, модификаторы биологических реакций, сукцинат, «Реамберин»©.

Туберкулез — инфекционное заболевание, вызываемое различными видами микобактерий (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis иM. africanum), с преимущественным поражением легких. Наибольший вклад в противотуберкулезный иммунитет вносят клеточные реакции с участием Т-хелперов, Т-киллеров и естественных киллеров, продуцирующих интерлейкин-2, хемокины и гамма-интерферон [3]. Т-хелперы специфически сенсибилизируются к микобактериальным антигенам, активируют фагоцитозную и бактериоцидную активность макрофагов. Т-киллеры способны оказывать прямое цитотоксическое действие на клетки, инфицированные микобактериями [2]. С помощью данных клеток изначально повышается бактерицидный потенциал макрофагов, а фагоцитоз приобретает завершенный характер. Особенно важна роль естественных киллеров на начальных этапах развития противотуберкулезного иммунитета, поскольку они способны немедленно разрушать инфицированные клетки и стимулировать развитие клеточного иммунного ответа. В экспериментальных работах по изучению противотуберкулезного иммунитета на мышах было описано повышение количества популяции естественных киллеров (ЕК) в легких животных в первые 3 недели после инфицирования.

Естественные киллеры — это клетки врожденного иммунитета, обладающие противоопухолевым и противовирусным иммунитетом, а также способные уничтожать клетки, инфицированные микроорганизмами (бактериями, простейшими и т. д.) путем выделения белков перфоринов и гранзимов, запускающих цикл реакций каспаз, приводящих клетку к апоптозу. Естественные киллеры в большом количестве выделяют цитокин гамма-интереферон, который способствует активации клеточного иммунитета. ЕК-клетки играют большую роль на ранних этапах инфицирования и запуска противотуберкулезного иммунитета [4].

При распространенных формах туберкулеза выявляется дефект антиген-специфического Т-клеточного ответа. Это проявляется в угнетении пролиферации периферических Т-лимфоцитов, снижении содержания Т-клеток. Это предопределяет развитие регуляторной, а при углублении патологического процесса — и структурно-функциональной вторичной иммунной недостаточности клеточного типа [2]. Поэтому единственными клетками, повышающими бактерицидный потенциал макрофагов на данной стадии заболевания, остаются естественные киллеры.

Цель исследования — изучение цитотоксического действия естественных киллеров крови здоровых доноров и пациентов, страдающих туберкулезом легких, после активации препаратом «Реамберин»©, содержащего сукцинат, в разных концентрациях.

Актуальность настоящего исследования обусловлена увеличением количества населения, инфицированного микобактериями туберкулеза, а также пациентов, имеющих диагноз туберкулез легких. Поиск природных модификаторов биологических реакций позволит повысить цитотоксичность естественных киллеров на ранних стадиях инфицирования и предотвратить развитие заболевания у пациентов.

Материал и методы.

В качестве объектов исследования использовали по 4 мл венозной крови от пяти практически здоровых доноров мужского пола первого периода зрелого возраста (контрольная группа) и по 4 мл венозной крови от пяти пациентов мужского пола, больных туберкулезом, первого периода зрелого возраста (опытная группа).

Методами исследования являлись культивирование, градиентное центрифугирование и световая микроскопия.

Цельная кровь практически здоровых доноров и пациентов, страдающих туберкулезом легких, была стабилизирована гепарином (20 ЕД/мл). Культивирование проводилось в стерильных пластиковых пробирках по 10 мл. Моделирование острого системного воспаления in vitro осуществлялось добавлением в культуральную среду вакцины БЦЖ. При этом добивались соотношения МПК: M. bovis = 1:5. В кровь добавляли препарат «Реамберин»© (1,5 %-400 мл), содержащий сукцинат, в трех концентрациях: 3 мг/мл, 5 мг/мл, 7,5 мг/мл. Кровь культивировали в течение 48 часов в CO2-инкубаторе при 36,6°С.

Через 48 часов мононуклеары периферической крови (МПК) здоровых доноров и пациентов, страдающих туберкулезом легких, выделяли методом градиентного центрифугирования [1]. Для этого 6 мл смеси наслаивали на 1,5 мл раствора фиколла (ρ=1,077 г/см3), трижды центрифугировали и отмывали. МПК подсчитывали в камере Горяева. Опухолевые клетки линии К-562 пересевали дважды в неделю. Их отмывали питательной бикарбонатной средой, подсчитывали в камере Горяева. Жизнеспособность мононуклеаров периферической крови и опухолевой линии К-562 составила более 96 %.

Иммунологическое исследование проводилось в плоскодонном иммунологическом планшете Terasaki. Одновременно на планшете проводились 4 серии экспериментов по 3 разведения с 3 повторами. Активность естественных киллеров определяли в краткосрочных (4-х часовых) тестах при соотношении эффектор-мишень 1:1, 1:10 и 1:100. Учёт теста проводили микроскопически путём подсчёта погибших клеток К-562 методом исключения красителя трипанового синего. Всего в ходе исследования было подсчитано 360 лунок.

Результаты и их обсуждение.

Ниже представлены графики с процентом гибели клеток опухоли К-562 под действием естественных киллеров в четырех сериях экспериментов в трех разведениях крови здоровых доноров (рис. 1) и пациентов, страдающих туберкулезом легких (рис. 2).

Рис. 1. Результаты цитотоксического теста здоровых доноров (средние значения по 5 донорам)

Рис. 2. Результаты цитотоксического теста пациентов, страдающих туберкулезом легких (средние значения по 5 пациентам)

В каждой из серии экспериментов был рассчитан процент гибели клеток опухоли К-562, а также проведен статистический анализ с подсчетом среднего значения, минимума, максимума, стандартного отклонения, стандартной ошибки. Процент гибели К-562 в контроле (МПК пациентов, страдающих туберкулезом легких + K-562 + M. bovis) был 4,1±0,5 % (1/1), 7,3±0,2 % (1/10) и 14,2±0,6 % (1/100). Процент гибели К-562 в контроле (МПК здоровых доноров + K-562 + M. bovis) был 5,5±0,9 % (1/1), 9,7±1,7 % (1/10) и 18,9±4,2 % (1/100). «Реамберин»© в концентрации 3 мг/мл: процент гибели К-562 (МПК пациентов + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 6,0±0,2 % (1/1), 7,9±0,3 % (1/10) и 17,9±0,6 % (1/100); процент гибели К-562 (МПК доноров + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 8,5±2,4 % (1/1), 11,6±2,3 % (1/10) и 22,5±5,1 % (1/100). «Реамберин»© в концентрации 5 мг/мл: процент гибели К-562 (МПК пациентов + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 6,2 ±0,3 % (1/1), 12,5±0,2 % (1/10) и 18,2±0,4 % (1/100); процент гибели К-562 (МПК доноров + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 8,8±1,7 % (1/1), 15,9±3,7 % (1/10) и 23,6±5,9 % (1/100). «Реамберин»© в концентрации 7,5 мг/мл: процент гибели К-562 (МПК пациентов + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 6,6±0,4 % (1/1), 13,1±0,3 % (1/10) и 17,7±0,6 % (1/100); процент гибели К-562 (МПК доноров + K-562 + M. bovis + сукцинат) был 9,4±1,8 % (1/1), 16,4±3,9 % (1/10) и 21,6±5,3 % (1/100).

Заключение.

Вакцина БЦЖ способствует активации цитотоксичности естественных киллеров, сукцинат является метаболическим стимулятором их активности. Наибольшая цитотоксичность естественных киллеров отмечается в разведении 1:100. Оптимальная концентрация препарата «Реамберин»© — 5 мг/мл — что соответствует рекомендуемой концентрации препарата для внутривенного введения. У пациентов с туберкулезом легких цитотоксичность естественных киллеров ниже, чем в контрольной группе здоровых доноров. Отмечается тенденция к увеличению цитотоксичности при увеличении разведения клеток-мишеней и клеток-эффекторов, а также при увеличении концентрации препарата «Реамберин»©.

Литература:

1.      Клаус, Дж. Лимфоциты: Методы. / Дж. Клаус. — М.: Мир, 1990. — С. 30–31.

2.      Морозкина, Н. С. Иммунодиагностика туберкулеза: Метод. рекомендации / Н. С. Морозкина, Н. С. Шпаковская. — Мн.: БГМУ, 2003. — 15 с.

3.      Перельман, М. И. Фтизиатрия: Учебник для студентов медицинских вузов / М. И. Перельман, В. А. Корякин. — М., 1996.

4.      Lotze, Michael T. Natural Killer Cells: Basic Science and Clinical Application. / Michael T. Lotze, Angus W. Thomson. — London: Elsevier, 2010. — 678 p.

Основные термины (генерируются автоматически): туберкулезом легких, здоровых доноров, естественных киллеров, гибели К-562, здоровых доноров и пациентов, МПК пациентов, крови здоровых доноров, МПК доноров, естественных киллеров крови, Процент гибели К-562, цитотоксичности естественных киллеров, гибели К-562 в контроле, гибели клеток опухоли, периферической крови, цитотоксичность естественных киллеров, мл венозной крови, заболеваемость туберкулезом легких, мононуклеары периферической крови, МПК здоровых доноров, противотуберкулезного иммунитета.

Ключевые слова

туберкулез легких, мононуклеары периферической крови, естественные киллеры, моди-фикаторы биологических реакций, сукцинат, «Реамберин»©

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle
Задать вопрос