Характер регенерации эпителия роговицы при лечении кератита аутоплазмой в сочетании с бандажной линзой



Цель работы: Оценить морфологические особенности динамики репаративной регенерации многослойного эпителия роговицы при лечении гнойного кератита с применением плазмы, обогащенной тромбоцитами и лейкоцитами (ОбТЛП), в сочетании с бандажной линзой (в эксперименте). Материал и методы. Модель гнойного воспаления роговицы в эксперименте воспроизводили на глазах свиней с последующим лечением кератита с применением ОбТЛП в сочетании с бандажной линзой. Результаты сравнивались с данными лечения гнойного кератита с применением стандартной антибактериальной терапии. Результаты. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование репаративной регенерации многослойного эпителия роговицы при лечении гнойного кератита с применением ОбТЛП в сочетании с бандажной линзой (в эксперименте) показало ускорение регенерации эпителия с полной эпителизацией поверхности роговицы многослойным плоским эпителием на 7-е сутки.

Ключевые слова : плазма, обогащенная тромбоцитами и лейкоцитами, бандажная линза, регенерация, эпителий роговицы, кератит.

Заболевания роговой оболочки глазного яблока остаются одной из ведущих причин понижения зрения, слепоты, гибели глаза. У 25–75 % больных заболевания роговицы осложняются снижением, а иногда и полной потерей зрения [2]. Этиопатогенетические факторы, приводящие к нарушению целостности и прозрачности роговой оболочки глаза, могут быть весьма разнообразны: воспалительные заболевания, травмы органов зрения, дистрофические изменения и их осложнения, васкуляризация различной степени, перфорация). Трудность и в большинстве случаев неэффективность проводимой терапии обусловливает актуальность проблемы регенерации роговицы при воздействиях на корнеа различных факторов.

Одну из ведущих ролей в заживлении роговицы играет ее передний эпителий. Недостаточность информации о его морфофункциональных изменениях в течении репаративного процесса роговицы указывает на необходимость дальнейшего изучения роли переднего эпителия в регенерации с целью разработки новых, патогенетически обоснованных методов лечения.

В последние годы в результате исследований механизмов регенерации и возможных путей управления ею появились относительно новые методы лечения воспалительных, дистрофических и язвенных поражений этой структуры глаза, в том числе с использованием плазмы, обогащенной тромбоцитами (ОбТП) [5, 7]. Применение ОбТП в офтальмологии и особенности ее воздействия на различные ткани глаза находится на стадии исследования. Показана эффективность применения глазных капель с ОбТП при лечении рецидивирующих эрозий роговицы, тяжелого синдрома сухого глаза, кератопатий [13, 15]. Изучается возможность использования плазмы, обогащенной тромбоцитами и лейкоцитами (ОбТЛП),представляющей собой более новое поколение концентратов тромбоцитов [8].

Важную роль в репарации роговицы играет прекорнеальная слезная пленка, являющаяся частью оптического аппарата глаза. Известно, что многочисленные биологически активные факторы, секретируемые слезной железой, влияют на пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток [14]. Разработка методов сохранения увлажнения поверхности глаза слезой во время терапии заболеваний роговицы, является патогенетически обоснованной. Показана эффективность применения временной блефарорафии, а также покрытия глазной поверхности амниотической мембраной при ожогах роговицы [4, 16]. Мы предлагаем применение ОбТЛП в сочетании с бандажной линзой в лечении гнойных кератитов. Бандажная линза– это биологически инертная повязка, проницаемая для кислорода, которая в силу своей эластичности повторяет рельеф роговицы и создает стабильную защитную стабилизирующую поверхность. Анализ зарубежной и отечественной литературы показал отсутствие информации о морфологических исследованиях регенерации роговицы при применении ОбТЛП в сочетании с бандажной линзой в лечении гнойных кератитов.

Цель работы. Оценить морфологические особенности динамикирепаративной регенерации многослойного эпителия роговицы при лечении гнойного кератита (ГК) с применением ОбТЛП в сочетании с бандажной линзой (в эксперименте).

Материалы и методы. Экспериментальные исследования проведены на базе Научно-исследовательского центра Государственного медицинского университета Туркменистана имени Мырата Гаррыева и Международного учебно-научного центра (МУНЦ) при Министерстве здравоохранения и медицинской промышленности Туркменистана. Для эксперимента использовали свиней белой крупной породы с массой тела 10–12 кг. Наблюдение, уход, операции на животных, а также выведение их из эксперимента производили в соответствии с «Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» [11]. Все животные находились в стандартных условиях содержания, на стандартном питании в виварии учебно-методической лаборатории МУНЦ.

Модель гнойного воспаления роговицы в эксперименте воспроизводили путём скарификации поверхности центральной оптической части роговицы и введением в полученный дефект чистой культуры золотистого стафилококка [10 ⁷ –10 ⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ)] с последующим зашиванием краёв век [3]. На 3 сутки у всех животных развивалась картина ГК, после чего начинали лечение. В зависимости от проводимого лечения все животные были разделены на две группы : I группа (9 животных) — группа сравнения: лечение ГК с применением стандартной антибактериальной терапии, II группа (9 животных) — опытная: антибактериальная терапия совместно с применением ОбТЛП в сочетании с бандажной линзой (ОбТЛП-БЛ). ОбТЛП получали путем забора 4 мл крови из вены уха свиньи в стерильные пробирки с 3,8 % раствором цитрата натрия. Для получения ОбТЛП кровь центрифугировали в течение 7 мин. при 3000 об/мин. После воспроизведения гнойного кератита ОбТЛП вводили одномоментно субконъюнктивально в опытный (левый) глаз в количестве 1,0 мл с последующим наложением бандажной линзы. Использовалась бандажная линза производства Корейской Народной республики (Interojo). Животные выводились из эксперимента передозировкой тиопентала натрия. Клинические признаки воспалительного процесса оценивались модифицированным тестом Draise [10].

На 3, 7, 14 сут сутки после начала лечения проводилась энуклеация экспериментального глаза. Гистологическому исследованию подвергалась ткань роговицы. Вырезанные кусочки роговицы фиксировались в 10 % растворе нейтрального формалина и заливались в парафин по общепринятой методике. Полученные парафиновые срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Морфометрическое исследование проводилось по методу Г. Г. Автандилова [1] и Weibel E. R. [17] с определением площади переднего эпителия роговицы и базального слоя. При стереометрическом исследовании применялась многоцелевая контрольная система с 21-ой линией «Z» для точечного подсчета средней площади структур. Характер деэпителизации роговицы (ДЭ) определяли по методу Рудько А. С. [4]. Иммуногистохимическое исследование с целью выявления экспрессии белков Кi-67 (маркер пролиферативной активности) и Bcl2 (антиапоптотический маркер) в эпителии проведено с применением антител к Ki-67 и Bcl2 согласно рекомендациям фирмы-производителя (Dako, Hamburg, Germany). Уровень иммуногистохимической окраски оценивали для каждого антитела в виде Score-показателя. Полученные данные статистически обработаны с помощью t-теста стандартного пакета Windows 2010.

Результаты и их обсуждение. При исследовании роговицы до лечения определялись клинические и морфологические признаки гнойного воспаления.

В динамике лечения оценка клинического состояния роговицы в баллах по Draiseпоказала статистически значимый регресс по клиническим признакам в обеих группах на всех сроках эксперимента с выраженным снижением баллов во II группе (p<0,05). В строме роговицы в обеих исследованных группах уже на 3 сутки лечения отмечалось затухание воспалительного процесса с уменьшением площади воспалительных инфильтратов в последующие сроки, однако во II группе динамика была более выражена, чем в I-ой (p<0,05).

На 3 день после начатого лечения с периферии роговой оболочки по направлению к центру ряды эпителиальных клеток формировали эпителиальный регенерат в виде клина, наползающего на зону деэпителизации. В перилимбальной зоне определялись эпителиоциты с фигурами митоза. Базофильная окраска их цитоплазмы была более выражена к глубжележащим слоям. В составе эпителиального регенерата обнаруживались единичные двуядерные клетки с измененными контурами ядра, в цитоплазме обнаруживались пигментные включения, аналогичные гранулам пигмента в клетках эпителия лимба. Клетки базального слоя, относящиеся к промежуточной популяции эпителиоцитов, в отдалении от лимба становились несколько ниже, ядра у большинства из них имели округлую форму, появлялись одиночные эпителиоциты, вытянутые параллельно базальной мембране, содержащие удлиненные ядра. Площадь базального слоя в очаге регенерации (табл.1) во II группе была достоверно выше, чем в I-ой на 3 сутки эксперимента (p<0,05). Однако в последующие сроки эксперимента отмечалась заметная динамика этого показателя в сторону снижения. Клетки базального слоя в обеих группах распространялись в направлении от лимба в сторону центра роговицы, при этом площадь базального слоя удаленно от лимба как на 3, так на 7 и 14 сутки во II группе была значительно больше, чем в I группе (p<0,05). Общая площадь переднего эпителия роговицы на 3 сутки увеличивалась, являясь больше во II группе, чем в первой (p<0,001). На 7 сутки этот показатель возрастал в обеих группах (p<0,05), но на 14 сутки снижался только во II группе (p<0,05).

Таблица1

Результаты морфометрии

группы	площадь переднего эпителия роговицы (мкм²), M ± m			площадь базального слоя (мкм²), M ± m			площадь базального слоя удаленно от лимба ( мкм² ), M ± m
	3 суток	7 суток	14 суток	3 суток	7 суток	14 суток	3 суток	7 суток	14 суток
I группа	1981,2±10,7	3455±43	3555±15,6	21,9±0,6	23,4±0,2	9,5±0,3	25±0,3	15±0,7	13±0,6
II группа	3070±55**	6234±34,8*	6234±34,8*	23,9±0,6*	13,6±0,7*	20,8±0,4*	27,7±0,07*	24±0,1*	28,4±0,9**

Примечание * — P<0,05; ** — P<0.001.

Зона деэпителизации во II группе на 3 день после начатого лечения с применением ОбТЛП-БЛ значительно уменьшалась (ДЭ=2), в то время как во I группе наблюдалось замедление эпителизации, и этот показатель был выше (ДЭ=3). К 7 суткам во II группе животных эпителиальный дефект роговицы был полностью закрыт многослойным плоским неороговевающим эпителием (ДЭ=0), адгезированным к боуменовой мембране, в то время, как в I группе сохранялись участки деэпителизации (ДЭ=2).

ИГХ исследование пролиферативной активности эпителиоцитов (рис. 1) в области регенерации роговицы на 3 сутки выявило увеличение числа пролиферирующих клеток с экспрессией Ki-67, преимущественно в базальном слое у зоны лимба с достоверной разницей во II группе (p<0,05). Положительно метились отдельные клетки шиповатого слоя. Известно, что антиген Ki-67, ассоциированный с хромосомами фазы митоза и представленный ядерным белком, экспрессируется в ядрах клеток, которые находятся в активной фазе клеточного цикла на всем его протяжении [18] и свидетельствует об интенсификации клеточного обновления в эпителиальном слое, более выраженном во II группе. К 7 суткам уровень экспрессии маркера пролиферации белка Ki-67 базальными клетками заметно уменьшался во II группе (p<0,05), оставаясь на этом же уровне в последующие сроки эксперимента. Однако в I группе показатель имел тенденцию к повышению.

Рис. 1. Показатели пролиферативной активности клеток эпителия

Исследование антиапоптотической активности эпителиоцитов (рис. 2) с помощью маркера Вcl2 показало более высокий уровень экспрессии протеина bcl2 клетками эпителия во II группе, по сравнению с I-ой на 3 сутки после лечения (p<0,05), что в совокупности с увеличением уровня экспрессии маркера пролиферации Ki-67 характеризует усиленную пролиферацию клеток с защитой их от апоптоза и возможностью выживания. Однако на следующих этапах во II группе показатель экспрессии протеина bcl2 достоверно снижался (p>0,05), значительно отличаясь от показателя I группы, обеспечивая дифференцировку эпителиоцитов на этом этапе регенерации.

Рис. 2. Показатели антиапоптотической активности клеток эпителия

Передняя пограничная мембрана роговицы на всем протяжении не во всех случаях сохранялась. В одном наблюдении I группы к 7 суткам отмечалось развитие абсцесса и язвы роговицы. Во II группе к этому сроку она выглядела в виде равномерно выраженной непрерывной оболочки.

Таким образом, при лечении ГК с применением ОбТЛП-БЛ(в эксперименте) установлено ускорение и активизация процессов регенерации эпителия (пролиферации, миграции, адгезии и дифференцировки эпителиоцитов), по сравнению с лечением ГК стандартной антибактериальной терапией. Известно, что тромбоциты в составеОбТЛП стимулируют процессы пролиферации, миграции и дифференцировки эпителиальных клеток за счет альфа-гранул, являющихся естественным депо факторов роста. Содержание в тромбоцитах адгезивных молекул (фибрина, фибронектина и витронектина) способствует более быстрому формированию «комплекса адгезии» по типу десмосомальных и полудесмосомальных контактов, прочность которых является одним из основных факторов нормального восстановления ее свойств в ходе регенерации [12]. Биологическая роль лейкоцитов определяется их фагоцитарными, регенераторными и эффекторными свойствами, а также способностью влиять на высвобождение некоторых факторов роста, особенно TGFβ1 [9]. Дополнительное применение бандажной линзы в сочетании с ОбТЛП способствует увлажнению поверхности глаза, необходимому для регенерации, а также защите пораженных тканей глаза от неблагоприятных факторов внешней среды.

Выводы. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование репаративной регенерации многослойного эпителия роговицы при лечении ГК с применением ОбТЛП-БЛ (в эксперименте) показало ускорение регенерации эпителия по гистотипическому типу (с восстановлением исходного типа ткани) с полной эпителизацией поверхности роговицы на 7-е сутки плотно адгезированным к боуменовой мембранемногослойным неороговевающим плоским эпителием. Применение ОбТЛП-БЛ в лечении ГК является патогенетически обоснованным и может быть рекомендовано к внедрению в практику офтальмологов.

Литература:

1. Автандилов Г. Г. // Медицинская морфометрия. / Руководство М., Медицина, 1990–384с.
2. Баранов В. И., Медведева М. В., Липатов В. А., Новикова А. А., Ярмамедов Д. М. Современные аспекты в лечении инфекционных заболеваний переднего отрезка глаза (обзор литературы) // Электронный научный журнал «Innova». — 2016. — № 2 (3). — С. 60–63.
3. Бибков М М., Суркова В. К. и соавт. «Способ моделирования бактериального кератита» (патент RU2480845)
4. Рудько А. С. Клинико-морфологическая оценка эффективности раннего применения временной блефарорафии, покрытия глазной поверхности амниотической мембраной и их сочетания при тяжелых щелочных ожогах роговицы и лимба в эксперименте. Дис.к.м.н.С-Петербург, 2015.149 с.
5. Тарабрина В.А. Влияние обогащенной тромбоцитами плазмы на репаративную регенерацию роговицы. ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова» МО РФ, 2020, т.1, с.257–260.
6. Федосеева Е. В., Ченцова Е. В., Боровкова Н. В. [и др.] Морфофункциональные особенности плазмы, богатой тромбоцитами, и её применение в офтальмологии // Офтальмология. — 2018. — № 15(4). — С.388–393.
7. Alio J. L., Arnalich‑Montiel F., Rodriguez A. E. The role of “eye platelet rich plas‑ma” (E‑PRP) for wound healing in ophthalmology. Curr Pharm Biotechnol. 2012 Jun;13(7):1257–1265.
8. Dohan Ehrenfest D. M., Bielecki T., Jimbo R.et al., Do the fibrin architecture and leukocyte content influence the growth factor release of platelet concentrates? An evidence-based answer comparing a pure platelet-rich plasm (P-PRP) gel and a leukocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF), Current Pharmaceutical Biotechnology, vol. 13, no. 7, pp. 1145–1152, 2012.
9. David M. Dohan Ehrenfest1,, Tomasz Bielecki, Ryo Jimbo, Giovanni Barbé, Marco Del Corso, Francesco Inchingolo and Gilberto Sammartino. Do the Fibrin Architecture and Leukocyte Content Influence the Growth Factor Release of Platelet Concentrates? An Evidence-based Answer Comparing a Pure Platelet-Rich Plasma (P-PRP) Gel and a Leukocyte- and Platelet-Rich Fibrin (L-PRF). Current Pharmaceutical Biotechnology, 2012, 13, 1145–1152
10. Douset O., Lanvin M., Thillou C. Reconstitutedhuman corneal epithelium:a new alternative to the Draize eye test for the assessment of the eye irritation potential of chemicals and cosmetic products. Toxicol. Votro. 2006. Vol. 20. P. 499–512
11. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for. Experimental and Other Scientific Purposes. (Strasbourg, 18.III.1986). http://base.garant.ru/4090914/ (access date: 11.12.2017). (In Russ.)
12. Fernández‑Barbero J., Galindo‑Moreno P., Avila‑Ortiz G., Caba O., Sánchez‑Fernández E., Wang H.‑L. Flow cytometric and morphological characterization of platelet‑rich plasma gel. Clinical oral implants research. 2007;17:687–93. DOI: 10.1111/j.1600‑0501.2006.01179.
13. Jun H., Myung J., Sang W., Hong K. /Autologous Platelet-rich Plasma Eye Drops in the Treatment of Recurrent Corneal Erosions. Korean Journal of Оphthalmology: KJO 2016;30(2):101–107
14. Klenkler B., Sheardown H & Jones L. Growth factors in the tear film: role in tissue maintenance, wound healing and ocular pathology. Ocul Surf.2007.5: 228– 239
15. Kojima T, Ishida R, Dogru M, et al. The effect of autologous serum eyedrops in the treatment of severe dry eye disease: a prospective randomized case-control study. Am J Ophthalmol. 2005;139:242–246
16. Kruse F.E, Rohrschneider K & Völcker HE.: Multilayer amniotic membrane transplantation for reconstruction of deep corneal ulcers. Ophthalmology. 1999.106: 1504– 1510
17. Weibel E. R., Stereological methods. Practical method of biological morphometry // London: Academic Press. -1979.- 415p.
18. Yerushalmi R. [et al.] /Ki67 in breast cancer: prognostic and predictive potential [Text] // Lancet Oncol. — 2010. — Vol. 11, № 2. — P. 174–83.