В статье авторы представляют способы выращивания организмов-деструкторов для очистки почв. Выделены и проведены скрининг активных штаммов-деструкторов и их способность к росту в присутствии нефти.
Ключевые слова: нефть, почва, углеводородокисляющие бактерии, биоремедиация.
Результаты анализа зависят от правильного отбора проб и их предварительной обработки. ИСО 10381–1 и ГОСТ 28168 устанавливают основные принципы, которые необходимо соблюдать при отборе образцов. Места отбора проб почвы на исследуемой территории намечают по координатной сетке с равными расстояниями. Среднюю смешанную пробу составляют из нескольких десятков проб.
Для получения средней пробы проводятся следующие манипуляции — сначала почву высыпают на лист бумаги тонким слоем, разрушают крупные сгустки почвы, далее удаляют из нее твердые включения, такие как кости, корни, раковины, а после этого делят почву на квадраты шпателем. Из каждого квадрата отбирают лопаточкой небольшое количество почвы, так, чтобы по возможности захватить всю толщину слоя. Растирание образца проводят в фарфоровой ступке. Далее растертый образец почвы просеивается через сито с диаметром отверстий в 1 мм до полного ее просеивания. Мелкозем диаметром 1 мм. (скелет почвы) помещают в бумажные пакеты с указанием номера разреза, макета его заложения и глубины взятия образца.
На среде мясопептонного агара была определена численность гетеротрофных микроорганизмов. Учет выросших колоний бактерий был проведен на 3–10 сутки с момента начала эксперимента.
Количество клеток выражается в количестве клеток или колониеобразующих единиц на 1 грамм сухого образца. Расчет средней арифметической и стандартного числа производился при n=6, p<0,01.
Выделение УОБ. Выделение бактерий из почв с территории Западно-Казахстанской области месторождения Карповский Северный Блок проводилось методом накопительных культур на питательной среде Ворошиловой-Диановой состава: (г/л) NH 4 NO 3– 1,0, K 2 HPO 4– 1,0, KH 2 PO 4– 1,0, MgSO 4– 0,2, CaCl 2 ·6H 2 O — 0,02, FeCl 3 — следы, pH = 7,0–7,2. В качестве источника энергии для бактерий использовали нефть в количестве 1 %.
Выделение чистых культур УОБ проводилось чашечным методом на питательной среде рыбо-пептонного агара при 28°С.
Рост микроорганизмов в присутствии углеводородов.
Способность выделенных УОБ расти на нефти, как на единственном источнике энергии для жизнедеятельности изучалась на питательной среде Ворошиловой-Диановой. Для этого в колбы Эрленмейера со 100 мл стерильной средой вносилось по 10 мл одной суточной культуры бактерий (инокулята) и добавлялось по 1 % нефти. Рост численности бактерий оценивался визуально по 5-бальной шкале на 14-е сутки эксперимента.
Выявление различных групп бактерий проводилось методом посева почвенной суспензии на питательной среде мясопептонного агара.
Сообщества бактерий, использующих в качестве энергии и углерода углеродсодержащие соединения (гетеротрофные бактерии) учитывались на питательной среде мясопептонного агара. Посевы выдерживались при температуре 28–30°С в течение 5–14 дней.
Таблица 1
Численность различных групп бактерий в отобранных образцах почвы
|
Группы микроорганизмов |
Численность микроорганизмов, КОЕ/г |
||
|
Контроль, 10 3 |
5 г/ кг почвы, 10 4 |
7 г/кг почвы, 10 4 |
|
|
Гетеротрофные бактерии |
54,2±1,2 |
21,3±1,1 |
14,9±1,4 |
|
Спорообразующие бактерии |
7,3±0,8 |
0,33±0,03 |
- |
|
Актиномицеты |
0,5±0,04 |
0,15±0,02 |
- |
|
а) контроль |
|
|
|
|
Рис. 1. Группы микроорганизмов в нефтезагрязненных образцах почвы
Содержание гетеротрофных микроорганизмов в контрольной почве намного выше, чем в нефтезагрязненных образцах: 54,2±1,2×103. Количество спорообразующих бактерий в контрольной почве 7,3±0,8×103 намного превышало их количество в нефтезагрязненном образце с 5 г/ кг. Количество актиномицетов 0,15±0,02×104 в почве с 5 г/ кг нефти намного ниже, чем в контроле 0,5±0,04×103. В образце с 7 г/кг нефти спорообразующие бактерии и актиномицеты выявлены не были.
В результате проведенной работы было выделено 178 изолятов, отличавшихся по форме, размеру, цвету и характеру поверхности колоний. В основном обнаруживались колонии микроорганизмов белого и кремового цвета. Около 70 % колоний имели гладкую поверхность, остальные — шероховатую.
Литература:
- Файзов К. Ш., Раимжанов М. М., Алимбеков Ж. С. Экология Мангышлак-Прикаспийского нефтегазового региона. Алматы. 2003.
- Оценка воздействия на окружающую среду биологического продукта, окисляющего нефть. ТОО «ЭКО-САФ», Атырау, 2018 год.
- О. А. Гоголева, Н. В. Немцева. Углеводородокисляющие микроорганизмы природных экосистем. Вестник Оренбургского научного центра Уральского отделения Российской академии наук (электронный журнал), 2012, № 2.
- Аббасян Ф. Изменения биоразнообразия в микробной популяции почв, загрязненных сырой нефтью / Ф. Аббасян, Р. Локингтон, М. Мегарадж, Р. Найду // Современная микробиология. — 2016. — Т. 72. — №. 6. — С. 663–670.
- Лим М. В. Комплексное руководство по технологиям восстановления загрязненных нефтью почв — текущие работы и будущие направления / М. В. Лим, Э. Фон Лау, П. Э. По // Бюллетень загрязнения моря. — 2016. — Т. 109. — С. 14–45.
- Ахмадиев М. В. Применение нативных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов в биоремедиации нефте-загрязненных почв и грунтов / М. В. Ахмадиев// Вестник Пермского национального исследовательского политехнического университета. Прикладная экология. Урбанистика. — 2014. — № 2(14). — С. 119–130.
