Получение экстракта и приготовление гистологических красителей из ежевики | Статья в журнале «Молодой ученый»

Отправьте статью сегодня! Журнал выйдет 6 марта, печатный экземпляр отправим 10 марта.

Опубликовать статью в журнале

Библиографическое описание:

Акмаммедова, М. О. Получение экстракта и приготовление гистологических красителей из ежевики / М. О. Акмаммедова, М. Г. Нурназаров. — Текст : непосредственный // Молодой ученый. — 2021. — № 2 (344). — С. 221-226. — URL: https://moluch.ru/archive/344/77467/ (дата обращения: 25.02.2021).



В связи с ухудшающейся экологической обстановкой в мире, человечество остро ощутило всю ценность средств, добытых из натуральных природных источников. Получение экстракта из ежевики (Rubus anatolicus), а также красителей для приготовления гистологических образцов позволяет расширить группы красителей растительного происхождения и упростить способы получения их из сырья с использованием нетоксичных веществ. В результате проведенных экспериментов были разработаны предложения по получению высококачественных красок из растительного сырья с высоким содержанием антоцианов и по приготовлению из них красителей.

В настоящее время имеет важное значение разработка и рациональное использование научных методов получения экологически чистых растительных красок из растений, растущих в Туркменистане, не оказывающих вредного воздействия на организм.

Ключевые слова : растение, ежевика, краски, красители, экстракт, ежевика, антоцианы, морфологические красители.

Важно всесторонне изучить особенности выращиваемой в Туркменистане ежевики (Rubus anatolicus), которая широко используется в качестве экологически чистого сырья, не оказывая вредного воздействия на организм, и широко применяется в народной медицине для лечения и питания [1].

Во флоре Туркменистана насчитывается около трех сотен видов красильных растений. Синтетические краски были созданы всего 150 лет назад, в то время как наши предки испокон веков окрашивали шёлк и шерсть природными красителями, получаемыми в основном из растений. Например, из цветков зверобоя продырявленного получали цветовую гамму — темно-фиолетовую и темно-красную, которую придавали материалу такие вещества, как гиперицин и псевдогиперицин. Ализарин, извлекаемый из корней марены красильной, имеет свойство окрашивать ткани в ярко-красный цвет. Дубильное вещество — танин, содержащееся в кожуре граната обыкновенного, дает возможность получить коричневый краситель. Распространенные растительные природные соединения флавоноиды предоставляют целый спектр цветов — красный, фиолетовый, синий и черный. Содержащиеся в листьях и стеблях растений хлорофиллы являются источником зеленой, а каротиноиды из цветков — красной, желтой и фиолетовой окрасок. Кроме марены красильной, наличие красящих веществ присуще многим представителям флоры Туркменистана. Краски, полученные из кожуры грецкого ореха, окрашивают шерсть и шелк в тона от песочного до черного. Красящие вещества листьев эремуруса придают шелку бледно-красный или оливково-медовый цвета, его цветки — серо-желтый, стебель — ореховый, а корни — медовый цвет. Ревень туркестанский — источник розового, кремового, сиреневого, черного цветов. Корни барбариса туркменского дают пигменты желтого, золотистого и красно-желтого цветов. Использование солодки позволяет получить желтую, зеленую, коричневую и красную краски. Семена гармалы окрашивают пряжу и ткани в различные оттенки желтого, коричневого, бежевого, а также в розовый и красный цвета. Галлы фисташки содержат пигменты, позволяющие окрашивать шерсть и шелк в малиновый, темно-серый и черный цвета [7].

Имеются данные об использовании в качестве растительного сырья для приготовления гистологических красителей ягод черники, плодов вороньего глаза и покровной чешуи луковиц лука. Все названные красители являются основными и окрашивают ядерные структуры (кариолимфу, хроматин и ядрышко) в фиолетовый (сок черники, плоды вороньего глаза, марены сердцелистной лесной, луносемянника, воронца заострённого) или коричневый (плоды черёмухи Мака, покровная чешуя лука репчатого) цвет. За исключением сока черники и покровной чешуи лука предложенные источники красильных веществ являются несъедобными или даже токсичными [2].

Подавляющее большинство гистологических красителей, используемых для изучения клеток и тканей органов в биологии и медицине, получают на основе химических технологий промышленного производства, сосредоточенного в основном в зарубежных странах. В классификации гистологических красителей отдельно выделена подгруппа красителей растительного происхождения, основным официальным представителем которой является гематоксилин, получаемый из кампешевого дерева, произрастающего в Центральной Америке [6].

Таким образом, несмотря на обилие красящих пигментов растений, имеющих обширный ареал произрастания в России, эта группа гистологических красителей остается малоизученной и несистематизированной.

В предыдущих исследованиях продемонстрированы простые и недорогие методики получения ядерных красителей (для изучения ядер и базофильных структур цитоплазмы клеток) на основе плодов черноплодной рябины, бузины черной, черной смородины и винограда сорта «Изабелла», широко культивируемых в Центрально-Черноземном районе России [3,4,5].

Общим для всех указанных плодов является значительное содержание антоциановых пигментов, имеющих в своей структуре оксониевый кислород, который может образовывать донорно-акцепторные связи с металлом — комплексообразователем протравных солей [8].

Плоды ежевики Плоды ежевики

Рис. 1. Плоды ежевики

Натуральные краски сохраняют свой цвет десятилетиями и не теряют своих качеств при различных неблагоприятных воздействиях. В связи с этим важно разработать и использовать соответствующие научные методы извлечения красителей из ежевики.

Целью настоящего исследованияявляются способы получения экстракта ежевики (Rubus anatolicus) и получение красителей из растительного сырья, возможности их применения в гистологии.

Материалы и методы . Исследования проводились в лабораторных условиях Государственного медицинского университета Туркменистана имени Мырата Гаррыева и Инженерно-технологического университета Туркменистана имени Огузхана. Плоды ежевики собирали в соответствии с необходимыми правилами, и был проведен следующий эксперимент для приготовления сырья поэтапно. Сырье плодов растения ежевики использовали для получения различных красителей на экспериментах. Для этого в большинстве случаев (50 %) используют этиловый спирт. В 50 мл полученного раствора красителя из ежевики добавили 20 мл калия алюминия и 1 мл водного раствора CH 3 COOH (уксусной кислоты).

В подготовленных образцах сравнительной группы гематоксилин окрашивали основными красителями, а в контрольной группе использовали краситель, полученный из экстракта свежих плодов ежевики. Полученные результаты морфологических исследований отдельных видов тканей и структуры клеток для достоверности проанализированы и обработаны статистически в соответствии с требуемыми правилами.

В результате были использованы все значимые среднестатистические методы. Таким образом, продолжаются соответствующие научные исследования для всестороннего изучения красителей, изготовленных из экстрактов плодов ежевики, которые мы предлагаем впервые, с помощью метода высокочувствительной хроматографии.

Экспериментальная часть . В начале использовались обычные методы морфологического окрашивания, а также красители, полученные путем добавления к предлагаемому нами экстракту ежевики других фиксирующих добавок. Результаты окрашиваний образцов следующие:

Для проведения эксперимента было создано семь групп, в каждой в качестве красителя использовано 0,5 мл экстракта ежевики. 0,5 мл экстракта ежевики в отдельных пробирках маркировали в возрастающей последовательности и помещены в специальный фиксатор, как показано на рисунке 2.

Препараты, приготовленные с помощью гистологических красителей из экстракта ежевики Препараты, приготовленные с помощью гистологических красителей из экстракта ежевики

Рис. 2. Препараты, приготовленные с помощью гистологических красителей из экстракта ежевики

  1. В контрольной группе, эозин-метилен, как функциональное различие для образцов (n = 10), окрашивали стандартными методами по Май-Грюнвальду и фиксировали в растворе аммиака и буферном фосфатном растворе.

Стандарт для приготовления этого раствора: 10 литров раствора можно приготовить, растворив 800 г NaCl, 20 г KCl, 144 г Na 2 HPO 4 и 24 г KH 2 PO 4 в восьми литрах дистиллированной воды, pH полученного раствора должен быть примерно 6,8–7,2. При необходимости кислотный pH можно отрегулировать окружающей средой или гидроксидом натрия и промыть дистиллированной водой, а затем высушить.

  1. В этойгруппе в стеклянную емкость отобрали 1,0 мл стандартного буферного фосфатного раствора (pH 6,8–7,2) и к нему добавили 0,5 мл предлагаемого нами экстракта ежевики и через 5–10 минут образовался светлый красно-коричневый красящий раствор.
  2. 1,0 мл буферного фосфатного раствора поместили в стеклянный контейнер и к нему добавили 0,5 мл предлагаемого нами экстракта ежевики и 0,5 мл раствора этилового (этанолового) спирта C 2 H 6 O и 0,3 мг купороса меди CuSO 4 , а затем встряхивали стеклянный контейнер, через 5–10 минут образовывался черно-синий (чернильный) красящий раствор.
  3. Буферного фосфатного раствора 1,0 мл поместили в стеклянный контейнер и к нему добавили 0,5 мл предлагаемого нами экстракта ежевики и 0,3 мг FeO 2, а затем встряхивали стеклянный контейнер до образования коричневатого (кофейного) красящего раствора.
  4. Далее 1,0 мл буферного фосфатного раствора поместили в стеклянный контейнер и к нему добавили 0,5 мл предлагаемого нами экстракта ежевики и 0,5 мл раствора этилового спирта и 0,3 мг FeSO 4 (железный купорос) и 1,0 мл CH 3 COOH (уксусная кислота). А затем встряхивали стеклянный контейнер до образования темно-синего (синего) красящего раствора.
  5. Затем 1,0 мл буферного фосфатного раствора поместили в стеклянный контейнер и к нему добавили 0,5 мл предлагаемого нами экстракта ежевики и 0,5 мл раствора этилового спирта и 0,5 мг FeSO 4 (железный купорос) и 0,3 мг CH 3 COOH (уксусная кислота), а затем встряхивали стеклянный контейнер до образования светло-красного красящего раствора.
  6. Впоследнейгруппе 1,0 мл буферного фосфатного раствора помещали в стеклянный контейнер и к нему добавили 0,5 мл предлагаемого нами экстракта ежевики и 0,5 мл раствора этилового спирта и 0,3 мг FeO 2 , 1,0 мл CH 3 COOH (уксусная кислота) и 0,5 мг NaHCO 4 (бикарбонат натрия), а затем встряхивали стеклянный контейнер до образования темного-серого красящего раствора. Для сравнения, образцы I и II группы (n=10) помещают в эозин-метилен синий и раствор Май-Грюнвальда, а также буферный фосфатный раствор и раствор Май-Грюнвальда. Для статистического анализа результатов морфологических и гистологических исследований использовалась программа Microsoft Office Excel.

При морфологическом и гистологическом исследовании препаратов в двух группах можно отметить, что тесты показывают одинаково общие патологические симптомы (изменения ядер, придатков клеток и т. д.). При сравнении результатов морфологических и гистологических исследований с описанными выше красителями, приготовленными из экстрактов ежевики (р <0,001), (р <0,01), (P <0,005), (P ≤0,05) статистическая точность явно отличается по сравнению с группой образцов, приготовленных с использованием существующих красителей. Можно отметить, что достоверность показателей в контрольной группе была нормальной по количеству клеточных входов органелл (р<0,05) и соотношению суммарных патологических изменений 3:1 (группа сравнения: контрольная группа).

Результаты морфологических исследований показали, что при использовании красителя, приготовленного из экстракта ежевики в сочетании с ранее использовавшимися морфологическими красителями, даже в течение относительно короткого времени (30 минут), можно точно определить внутриклеточные изменения и патологические отклонения (можно определить четкие гистоморфологические признаки) по сравнению с контрольной группой. В то же время в результате сочетанного окрашивания, по сравнению с существующими методами, необходимо (обязательно) определить дистрофические образования, например, чтобы отличить патологический процесс от воспаления, а также имеет очень большое значение оценка процесса регенерации. Следует также отметить, что ранее приходилось использовать краски Судан III и Шарлах красного цвета, чтобы увидеть жировые ткани, но предлагаемые нами красители окрашивают все жиры и липиды от светло-оранжевого до желтого, что очень важно для точной идентификации различных патологических процессов.

В связи с этим, тот факт, что краситель, представленный в основной группе, превосходит образцы, приготовленные из существующих красок, очень впечатляет и, как обычно, не требует лишних затрат и дополнительного времени. Это еще раз свидетельствует об их важности по сравнению с ранее существующими красителями.

Гистоморфометрические сравнения различных красителей из экстракта ежевики с существующими методами показаны в таблице.

Таблица 1

Гистоморфометрическое сравнение различных красителей, изготовленных из экстракта ежевики, с существующими методами: патологические явления (n-10)

Экстракт ежевики и др. Красители

Контрольная группа

Основная группа

p- показатель

1.

Эозин-метилен и раствор Май-Грюнвальда

3,2± 1,2

3,6± 1,5

P<0,001

2.

Буферный фосфатный раствор и раствор Май-Грюнвальда

5,4±1,1

3,8±1,2

P<0,005

3.

Буферный фосфатный раствор, измельченный экстракт, медный купорос.

3,6±1,05

6,6±1,8

P<0,05

4.

Буферный фосфатный раствор и предлагаемый на нем измельченный экстракт и FeO 2

3,2±0,8

4,3±0,7

P<0,01

5.

Буферный фосфатный раствор и измельченный экстракт, спиртовой раствор, FeO 2 и уксусная кислота.

3,3±1,4

5,1±1,4

P<0,05

6.

Буферный фосфатный раствор, измельченный экстракт, спиртовой раствор, FeO 2 и уксусная кислота.

3,8±1,9

5,6±0,49

P<0,01

7.

Буферный фосфатный раствор, неочищенный экстракт, спиртовой раствор, FeO 2 и уксусная кислота, и бикарбонат натрия

1,18±0,26

1,09±0,25

P<0,01

* р<0,001 **р<0,01; ***P<0,005; ****(P≤0,05); — с контрольной группой

Сравнение гистоморфометрически концентрированной дифференциации поля различными методами различных красителей из ежевики экстракта. Поместили 100 г свежесобранных ягод ежевики в специальные фильтровальные тканевые пакеты, а подготовленные пакеты поместили в 50–50-кратном растворе этилового спирта в очень распространенном и широко применяемом технологическом методе экстракции. В течение 3 часов мы экспериментировали с фильтрацией кипячением. Порядок проведения эксперимента показан на рисунке 3.

Извлечение экстракта из плодов ежевики Извлечение экстракта из плодов ежевики Извлечение экстракта из плодов ежевики

Рис. 3. Извлечение экстракта из плодов ежевики

В итоге 400 мл 50 % раствора этилового спирта из сырья 70 г спелых плодов, с гладким темно-красным блеском, образовалась жидкость. Экстракт выдерживали до появления более густого раствора. Высокое содержание активного пигмента, как показано выше, в экстракте из свежих плодов ежевики, позволяет использовать это средство в будущем как новую форму красителей в лечебных и биологических целях.

Проблема научного исследования. Эта работа позволит расширить группы красителей, получаемых из растений, упростить способы получения различных красителей из сырья с использованием нетоксичных веществ. Результаты экспериментов показывают, что экологически и экономически более целесообразно получать высококачественные красители из растительного сырья, содержащего большое количество антоцианов, и широко использовать их в качестве красителей, используемых для изготовления морфологических образцов в прикладной медицине и биологии.

Разработан новый метод извлечения ягод из плодов ежевики. Его также сравнивали с предыдущими методами для первого экстракта плодов ежевики путем окрашивания и экстракции крупномасштабного красителя при взаимодействии с различными химическими веществами. Полученный продукт сушили и экстрагировали 50 % этиловым спиртом в соотношении 1:10 в течение 3 часов путём фильтрации.

В современных требованиях стандартизации систематическая цепочка использования показателей качества ресурсов «Сырье из лекарственных растений» объективно обоснована и позволяет разработать характеристики показателей качества. Важной задачей является полное изучение химического состава сырья ягод ежевики и получение и приготовление подходящих средств с соответствующих подстанций.

Результаты и обсуждение. Впоследние годы ряд авторов предложили несколько методов для многогранного изучения растений и разработки новых фитохимических препаратов. При анализе представленных данных необходимо точно определить качество и зрелость растений при получении высококачественного сырья.

Ссылаясь на правила сбора и приготовления лекарственных растений в источниках, период подготовки лекарственного растения можно рассматривать как время подготовки плодов в период цветения, то есть время отбора сырья. Это включает интегрированную и измельченную форму фрукта «Внешнее описание сырья».

Многие исследования показали тот факт, что в период плодоношения биологически активные вещества растений различаются. Если изучить сырье плодов предварительно собранного растения, можно отметить, что высокоактивных веществ, содержащихся в нем, очень мало или они полностью отсутствуют. Для того, чтобы выбрать сырье для приготовления экстракта, необходимо доработать раздел «Микроскопия», чтобы выявить какие-либо нарушения его правил. В результате 50 % экстракции 100 г этилового спирта из сырья плодов ежевики было получено 7 г чистого экстракта. Эта цифра эквивалентна соотношению 1:10, что подтверждает наличие огромного производственного потенциала.

Выводы

В эксперименте определена высокая продуктивность плодов ежевики. Использование красителей, приготовленных из экстракта ежевики, идентично с ранее существовавшими методами. Морфологический анализ подчеркивает более точное определение патологических изменений на клеточном уровне и за его пределами. Предлагаемый выше метод получения экстракта растения ежевики и приготовления из него красителей можно применять не только в морфологической лаборатории, но и в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности .

Литература:

1. Berdimuhamedow Gurbanguly «Türkmenistanyň dermanlyk ösümlikleri», Aşgabat, I — tom, 2009ý.

2. Ишунина Т. А., Барабанщикова Т. Н., Сгонникова А. О. //Морфологические ведомости 2014// 2014. -N 1. с.112–114.

3. Ишунина Т. А. Гистологические красители на основе экстрактов ягод винограда и черной смородины // Морфологические ведомости. 2015. № 4. с. 65–68.

4. Ишунина Т. А. Разработка технологии приготовления красителей для гистологических целей на основе экстрактов растений // Структура и физико-химические свойства целлюлоз и нано композитов на их основе. Пет-разводок, 2016. с. 111–115.

5. Ишунина Т. А., Солоненко О. В. Гистологический краситель на основе антоцианов ягод черноплодной рябины (Aronia melanocarpa) //Морфологические ведомости. 2014. № 4. с. 58–61.

6. Коржевский Д. Э. Применение гематоксилина в гистологической технике // Морфология. 2007. Т. 132. № 6. с. 77–82.

7. Растения — натуральные красители 252 /Константин Головкин, Институт лекарственных растений АН Туркменистана, фото автора /12.06.2012 / Наука.

8. Horbowicz M., Kossan R., Grzesiuk A., Debski H. Anthocyanin’s of fruits and vegetables — their occurrence, analysis and role in human nutrition // Veg Crops Res Bull. 2008. Vol. 68. Pp. 5–22.

Основные термины (генерируются автоматически): экстракт ежевики, буферный фосфатный раствор, стеклянный контейнер, краситель, COOH, этиловый спирт, контрольная группа, уксусная кислота, мл раствора, растительное сырье.


Ключевые слова

растение, антоцианы, красители, ежевика, краски, экстракт, морфологические красители
Задать вопрос