Особенности течения описторхоза у ВИЧ-инфицированных пациентов: клинические случаи



Статья посвящена актуальной проблеме паразитарной инвазии, в частности, описторхоза у ВИЧ-инфицированного контингента, в связи с его широкой распространенностью и негативным влиянием на организм. Представлены два клинических примера течения ВИЧ-инфекции в сочетании с описторхозом у пациентов с антиретровирусной терапией и без нее. Клиническая картина описторхоза у ВИЧ-инфицированных пациентов была схожа с клиникой данного заболевания у людей без ВИЧ-инфекции, но характеризовалась преобладанием выраженных аллергических проявлений, сопровождающимся резким падением показателей иммунного статуса.

Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, гельминтозы, описторхоз

The article is devoted to the actual problem of parasitic invasion, in particular, opisthorchiasis in HIV-infected population, due to its wide prevalence and negative impact on the body. Two clinical examples of the course of HIV infection in combination with opisthorchiasis in patients with and without antiretroviral therapy are presented. The clinical picture of opisthorchiasis in HIV-infected patients was similar to the clinic of this disease in people without HIV infection, but was characterized by a predominance of pronounced allergic manifestations, accompanied by a sharp drop in immune status indicators.

Key words: HIV infection, helminth infection, opisthorchiasis

Введение

Проблема гельминтозов у ВИЧ-инфицированных лиц исключительно актуальна ввиду широкой распространенности паразитарных инвазий во всем мире. Для ВИЧ-инфицированных пациентов при измененном иммунитете паразитарные инвазии могут представлять реальную угрозу для жизни [1].

В Российской Федерации в 26 субъектах широко распространен описторхоз, где в различных областях его число варирует от 20 до 200 на 100 тысяч населения и занимает до 74,4 % в доле других инвазий [2]. Средний показатель заболеваемости описторхозом 52,8 % и 90 % — приходится на долю жителей Западной Сибири, Ямало-Ненецкого края и Дальнего Востока, что обусловлено наличием крупнейшего в мире Обо-Иртышского очага [3]. Очаги описторхоза концентрируются вблизи водоемов. Природные очаги описторхоза Волго-Камский, находятся в районах Татарстана и Башкирии [4]. Здесь зарегистрированы местные случаи описторхоза и условия для поддержания природных очагов на этих территориях: зараженность рыбы, домашних и некоторых видов диких животных, промежуточного хозяина моллюска. За последние годы наметилась тенденция увеличения заболеваемости описторхозом на 10 %, что обусловлено миграционными процессами среди населения России и ухудшает эпидемическую ситуацию по описторхозу [5]. С 2011–2019 годы наблюдается рост заражений описторхозом от готовой рыбной продукции в копченом, вяленом виде, а также употреблением в пищу суши из сырой и недостаточно обработанной рыбы, поэтому 75–78 % случаев описторхоза приходится на долю городского населения [6].

Возбудителем описторхоза в Российской Федерации является трематода Opisthorchis felineus -кошачья или сибирская двуустка. Развитие этой трематоды происходит с тройной сменой хозяев: двух промежуточных (моллюски, рыбы) и окончательного (млекопитающие, в том числе человек) [7]. Естественная восприимчивость людей к заражению высокая, особенно при сниженном иммунитете. Часты случаи повторного заражения после излечения [8]. Приток значительного числа неиммунного населения из неэндемичных регионов по описторхозу, привел к их массовым заражениям возбудителем описторхоза с характерной острой стадией заболевания [9]. В ранней стадии описторхоза основным является токсико-аллергический синдром, который обусловлен воздействием метаболитов, выделяемых личинками гельминтов при их миграции и созревании. Широкий спектр сочетанных с описторхозом заболеваний, особенно в возрастной категории 45–60 лет при повторных заражениях приводит к суперинвазивному описторхозу [9].

ВИЧ-инфекция, отягощенная гельминтозами, по мнению некоторых авторов, протекает более тяжело с выраженным полиморфизмом клинических проявлений [10]. Одной из таких инфекций является описторхоз при котором иммуносупрессивное действие трематоды Opisthorchis felineus оказывает негативное воздействие на лиц с иммунодефицитом — ВИЧ-инфицированных пациентов [11;12].

Цель исследования. На клинических примерах проанализировать особенности течения ВИЧ-инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов с описторхозом в острой стадии.

Обсуждаемые в научной литературе проблемы иллюстрируют два нижеприведенных клинических примера больных ВИЧ-инфекцией с диагностированным описторхозом, где показаны особенности течения ВИЧ-инфекции, осложненной данной паразитарной инвазией.

Материалы и методы.

Объектом исследования стали пациенты с ВИЧ-инфекцией в субклинической стадии 3 (В23.1), находящиеся на диспансерном наблюдении в ГБУЗ РЦПБ со СПИДом и ИЗ РБ с подтвержденным сопутствующим диагнозом -описторхоз в острой стадии.

Использовались клинические, лабораторные с использованием клинического и биохимического анализов и инструментальные исследования. В лабораторных исследованиях для обнаружения паразитарной инвазии использовали копроовоскопию (методы обогащения)- метод толстого мазка под целлофаном по Като и Миура и фармалин-эфирным методом, для определения наличия антигенов описторхов в сыворотки крови проводилась полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и выявления антител к описторхам использовался иммуноферментный анализ (ИФА) В инструментальных исследованиях использовали ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости и выявление степени фиброза печени фиброэластометрией печени.

Обсуждаемые в научной литературе проблемы иллюстрируют два нижеприведенных клинических примера больных ВИЧ-инфекцией с диагностированным описторхозом, где показаны особенности течения ВИЧ-инфекции, осложненной данной паразитарной инвазией.

Клинический случай 1.

Больной М., 35 лет. Обратился в Центр ГБУЗ РЦПБ со СПИДом и ИЗ РБ в 2017 году с жалобами на головную боль, боли в области живота и правом подреберье, тошноту, частый жидкий стул, кожный зуд, крапивницу, лихорадку до 38,2 градусов С.

Принимал дома самостоятельно жаропонижающие препараты, без эффекта. Из анамнеза: диагноз поставлен в октябре 2017 года — ВИЧ-инфекция с персистирующей лимфоаденопатией в субклинической стадии III В-23. На АРТ не находился. Жалоб не было, к врачам не обращался. При постановке на учет в общем анализе крови и биохимии отклонения не было. Употребление наркотических препаратов отрицает. Эпидемический анамнез: частое употребление в пищу сушеной и сыро-копченой рыбы, суши.

При обследовании: умеренная миалгия, гиперемия зева, диспепсический синдром, лабильность вегетативной системы — бессонница, утомляемость; температура до 37,9 С; при осмотре — живот симметричный, печень увеличена на 0,5 см, гепатобилиарный синдром — болезненность в области правого подреберья и гастроэнтероколитический синдром — болезненность в эпигастральной области.; увеличены подчелюстные лимфоузлы; кожные покровы — аллергическая экзантема в виде уртикарной сыпи в области живота, плечевого пояса.

УЗИ брюшной полости:

Заключение: дискинезия желчного пузыря и ЖВП, хронический холецистит, диффузные изменения паренхимы печени, холестатический гепатоз, признаки панкреатита.

Фиброэластометрия: F2=7,3 кПа — фиброз средней степени.

Таблица 1

Результаты общего анализа крови в лейкоформуле

Лейкоциты 10х9/л-	Эозинофилы %	Базофилы %	Нейтрофилллы юные %	Нейтрофилы Палочкояд %	Нейтрофилы Сегментояд %	Лимфо циты %	Моно циты %	СОЭ
Норма	1–5	0- 1	0- 1	1- 6	47–72	19- 37	3–11	8–10
Показатели до лечения	25	3	0	4	50	33	12	27
Показатели после лечения	5	1	0	2	51	35	6	10

Таблица 2

Результаты биохимического анализ крови

Анализ:	Норма показателей	Результаты
Общий белок	64–84 г/л.	62 г/л.
Гаптоглобин	150–2000 мг/л	200 мг/л
Глюкоза	3,30–5,50 ммоль/л.	4,8 ммоль/л.
Мочевина	2,5–8,3 ммоль/л.	3,5 ммоль/л.
Креатинин	62–115 мкмоль/л	64 мкмоль/л.
Холестерин	3,5–6,5 ммоль/л.	6,8 ммоль/л.
Билирубин	5–20 мкмоль/л.	37 мкмоль/л.
АлАТ (АЛТ)	до 45 ед/л.	121 ед/л.
АсАТ (АСТ)	до 45 ед/л.	97 ед/л.
Липаза	0–190 ед/л.	120 ед/л.
Альфа-амилаза	28–100 ед/л.	93 ед/л.
Панкреатическая амилаза Гемоглобин	0–50 ед/л. 130 -160 г/л	46 ед/л. 110 г/л

Показатели иммунограммы: Т- лимфоциты субпопуляции — СD3+клетки — 680 кл/мкл (норма 600–900 кл/мкл), CD4+ клетки — 520 кл/мкл (норма 400–950 кл/мкл), CD8+ клетки — 1048 кл/мкл (норма 370–974 кл/мкл); Вирусная нагрузка — 1340 копий /л.

Анализ выявления гельминтозов — копроовоскопия — 2-х кратная была положительной, обнаружились яйца описторхов (кошачей двуустки). Анализ ПЦР был положительный к описторхам. ИФА показал наличие IgM — 3,2 г/л (норма 0,4–1,2 г/л) и IgG — 14,8 г /л (норма 7–13 г/л), IgE — 195,5 МЕ/мл (норма 30–145 МЕ/мл).

Результат биохимического анализа крови показал цитолитический синдром и средний холестаз. Исследования фибробластометрии и УЗИ выявили развитие фиброза, уплотнение печени, снижение эластичности и жесткости очагового характера, диффузные изменения паренхимы печени, повреждения печени воспалительного характера, что может быть отражением инвазии гельминтами.

На основании проведенного клинико-лабораторного обследования и учитывая основной диагноз поставлен сопутствующий диагноз — описторхоз гепатохолангитический в острой стадии. Назначен и проведен стандарт лечения описторхоза — трех- этапное подготовительное (в течении10 дней) и антигельминтное лечение препаратом Празиквантел (Бильтрицид) 60 мг на 1 кг массы тела больного по схеме — по 60 мг внутрь после еды в 6 приемов: в первые сутки — через каждые 4 часа, вторые и третьи сутки — через каждые 6 часов, курс 3 дня. Подготовительная терапия для улучшения оттока из желчевыводящих путей и протоков поджелудочной железы, восстановления моторно-кинетической функции ЖВС, снятия интоксикации и воспалительного синдромов включала противовоспалительную терапию — антибиотики курс 5 дней, желчегонные, спазмолитики и холикинетики в течение 10 дней. Для купирования аллергического синдрома назначены антигистаминные препараты в течение 5 дней. Реабилитационная терапия для дуаденального зондирования и адсорбции токсинов включала желчегонные препараты и сорбенты, для восстановления биоценоза кишечника назначены пробиотики, для восстановления функции печени назначены гепатопротекторы.

В динамике наблюдения состояние больного улучшилось, прошла интоксикация, диспепсический синдром, боли в правом подреберье и эпигастральной области, нормализовалась температура тела.

В крови показатели лейкоформулы в пределах нормы, эозинофилии нет. СОЭ- 10 мм/ч. Показатели биохимического анализа крови в пределах нормы, за исключением показателя гемоглобина Нв -110 г/л. При исследовании показателей клеточного иммунитета выявлена нормализация абсолютного числа субпопуляций лимфоцитов: СD3+клетки — 880 кл/мкл, CD4+ клетки — 630 кл/мкл, CD8+клетки — 1030 кл/мкл; вирусная нагрузка — 1338 копий /л.

После окончания лечения на второй месяц были проведены повторные лабораторные исследования на наличие гельминтозов — копроовоскопия не выявила яиц описторхов. Анализ ПЦР показал отрицательный результат к описторхам. ИФА выявил IgG — 6,6 г /л (в пределах нормы).

Больному М. назначена АРТ по стандартной утвержденной схеме I ряда: ламивудин/зидовудин, эфавиренц.

Обращает внимание состояние иммунного статуса: у больного М. состояние Т — клеточного иммунитета было на достаточно хорошем уровне (значения субпопуляции CD4+; CD3+; CD8+ лимфоцитов), но при этом наблюдалась высокая вирусная нагрузка РНК ВИЧ, а после дегельминтизации параметры Т-клеточного звена иммунитета нормализовались, хотя при этом вирусная нагрузка осталась почти на том же уровне. Уровень иммуноглобулинов — IgM и IgG был повышен, что соответствует острому периоду паразитарной инвазии., обнаруживался IgE, характерный для аллергенного фона при описторхозе. Отмечается высокая степень эозинофилии у пациента с ВИЧ-инфекцией, отягощенного описторхозом в острой стадии.

На данном примере показано, что течение ВИЧ-инфекции в сочетании с описторхозом клинически можно принять за прогрессирование ВИЧ-инфекции и переход в стадию вторичных заболеваний с похожей симптоматикой. В подобных случаях необходимо всестороннее клинико-лабораторное обследование пациента с ВИЧ-инфекцией, включающее паразитологические методы лабораторной диагностики.

Клинический случай 2.

Больной Р., 42 года. Состоит на диспансерном учете по поводу ВИЧ-инфекции с мая 2016 года. Обратился в Центр ГБУЗ РЦПБ со СПИДом и ИЗ в сроки полугодового наблюдения в 2017 году. Жалобы на периодические высыпания на коже и слизистых в виде крапивницы, головную боль, припухлость век, общее недомогание, нарушение сна, периодический озноб, температура 37,3–37,8 С.

Из анамнеза: диагноз поставлен в мае 2016 года — ВИЧ-инфекция с персистирующей лимфоаденопатией в субклинической стадии III В-23.1.

С 2016 года на АРТ по схеме 1: ламивудин/зидовудин, эфавиренц. АРТ переносил хорошо, побочных явлений не зарегистрировано. Эпидемический анамнез: работает вахтовым методом в районе Нижневартовска, где расположен природный Обский очаг описторхоза, досуг — занимается рыбной ловлей на реке Обь и ее притоках.

При обследовании: опухлость век, желтизна склеры глаз, слабость, утомляемость, температура до 37,9 С; при осмотре — живот симметричный, печень не увеличена, гастроэнтероколитический синдром — легкая болезненность в эпигастральной области.; кожные покровы — макулопапулезная экзантема в виде крапивницы на коже рук и туловище.

УЗИ брюшной полости:

Заключение: диффузные изменения печени и поджелудочной железы, дискинезия ЖВП, хронический холецистит, калькулезный холецистит.

Фиброэластометрия: F2=8,5 кПа — фиброз средней степени

Таблица 3

Результаты общего анализа крови в лейкоформуле

Лейкоциты 10х9/л-	Эозинофилы %	Базофилы %	Нейтрофилллы юные %	Нейтрофилы Палочкояд %	Нейтрофилы Сегментояд %	Лимфо циты %	Моно циты %	СОЭ
Норма	1–5	0- 1	0- 1	1- 6	47–72	19- 37	3–11	8–10
Показатели до лечения	27	3	1	8	48	27	12	30
Показатели после лечения	5	1	0	2	51	35	6	12

Таблица 4

Результаты биохимического анализ крови

Анализ:	Норма показателей	Результаты
Общий белок	64–84 г/л.	70 г/л.
Гаптоглобин	150–2000 мг/л	380 мг/л
Глюкоза	3,30–5,50 ммоль/л.	6,2 ммоль/л.
Мочевина	2,5–8,3 ммоль/л.	4.6 ммоль/л.
Креатинин	62–115 мкмоль/л	86 мкмоль/л.
Холестерин	3,5–6,5 ммоль/л.	7,4 ммоль/л.
Билирубин	5–20 мкмоль/л.	28 мкмоль/л.
АлАТ (АЛТ)	до 45 ед/л.	106 ед/л.
АсАТ (АСТ)	до 45 ед/л.	86 ед/л.
Липаза	0–190 ед/л.	150 ед/л.
Альфа-амилаза	28–100 ед/л.	85 ед/л.
Панкреатическая амилаза Гемоглобин	0–50 ед/л. 130–160 г/л	32 ед/л. 130 г/л

Показатели иммунограммы: Т- лимфоциты субпопуляции — СD3+клетки — 690 кл/мкл (норма 600–900 кл/мкл), CD4+ клетки — 745 кл/мкл (норма 400–950 кл/мкл), CD8+клетки — 1170 кл/мкл (норма 370–974 кл/мкл); Вирусная нагрузка РНК ВИЧ — 280 копий /л.

Анализ выявления гельминтозов — копроовоскопия 2-х кратная была положительной, обнаружились яйца описторхов. Анализ ПЦР был положительный к описторхам.

ИФА показал наличие IgM -6,5 г/л (норма 0,4–1,2 г/л), IgG — 16,2 г /л (норма 7–13 г/л), IgE -248,6 МЕ/мл (норма 30–145 МЕ/мл).

Результат биохимического анализа крови показал повышенные показатели АЛТ и АСТ, билирубина и холестерина. Исследования фибробластометрии и УЗИ выявили развитие фиброза, уплотнение печени и умеренное снижение эластичности, диффузные изменения паренхимы печени и поджелудочной железы, что может указывать на возможную инвазию гельминтами.

На основании проведенного клинико-лабораторного обследования поставлен сопутствующий диагноз — описторхоз тифоподобный в острой стадии. Назначен и проведен стандарт лечения описторхоза: трехэтапное подготовительное и антигельминтное лечение препаратом Празиквантел (Бильтрицид) 60 мг на 1 кг массы тела больного по следующей схеме: по 60 мг внутрь после еды в 6 приемов: в первые сутки — через каждые 4 часа, вторые и третьи сутки — через каждые 6 часов, курс 3 дня. Подготовительная терапия для улучшения оттока из желчевыводящих путей и протоков поджелудочной железы, восстановления моторно-кинетической функции ЖВС, снятия интоксикации и аллергического и воспалительного синдромов включала противовоспалительную терапию — антибиотики курс 5 дней, противоаллергические препараты в течении 5 дней, желчегонные, спазмолитики и сорбент в течении 10 дней. Реабилитационная терапия включала желчегонные препараты холикинетического и холиретического действия и сорбенты в течение 10 дней, пробиотики, гепатопротекторы для защиты клеток печени от повреждающего действия токсического фактора в течении 20 дней.

В динамике наблюдения состояние больного улучшилось, прошла интоксикация, слабость, головные боли, боли в эпигастральной области, нормализовалась температура тела.

В крови показатели лейкоформулы в пределах нормы, эозинофилии нет. СОЭ — 12 мм/ч. Показатели биохимического анализа крови в пределах нормы, за исключением холестерина — 6,8 ммоль/л.

При исследовании показателей клеточного иммунитета выявлена нормализация абсолютного числа субпопуляций лимфоцитов: СD3+клетки — 820 кл/мкл, CD4+ клетки — 968 кл/мкл, CD8+клетки — 952 кл/мкл; Вирусная нагрузка РНК ВИЧ существенно снизилась до 84 копий/л.

После окончания дегельминтизации были проведены повторные лабораторные исследования: копроовоскопия дала отрицательный результат — не выявила яиц описторхов. ПЦР отрицательная к описторхам.

ИФА выявил IgG -7,2 г /л и IgE -72,2 МЕ/мл. (в пределах нормы). АРТ была продолжена по прежней схеме. Отдаленные наблюдения за состоянием течения ВИЧ-инфекции у больного Р. в течение 6 месяцев побочных явлений и аллергических проявлений на проводимую АРТ не показали.

Таким образом, у больного Р., после проведенного лечения противогельминтным препаратом и восстановительной терапии произошла нормализация показателей Т-клеточного иммунитета абсолютного числа субпопуляций лимфоцитов — СD3+; CD4+; CD8+ клеток; вирусная нагрузка РНК ВИЧ снизилась, показатели лейкоформулы в пределах нормы, что говорит об эффективности проводимой дегельментизации на фоне АРТ у ВИЧ-инфицированного пациента.

Заключение.

В последнее десятилетие произошел кардинальный прогресс в лечении ВИЧ-инфицированных пациентов, увеличивающий качество и продолжительность их жизни. Большое внимание сейчас уделяется диагностике и лечению сопутствующих и оппортунистических заболеваний при ВИЧ-инфекции, которые в подавляющем большинстве утяжеляют течение ВИЧ-инфекции и являются причинами летальных исходов. Паразитарные инвазии могут быть сопутствующими заболеваниями при ВИЧ-инфекции, одной из видовых разновидностей которых является описторхоз. Следует отметить, что клиническая картина описторхоза у ВИЧ-инфицированных пациентов схожа с клиникой данного заболевания у людей без ВИЧ-инфекции, но по наблюдениям характеризуется яркой аллергической симптоматикой. В данных клинических примерах прослеживается яркий энтероколитический синдром, выраженный субфебрильной лихорадкой, выраженной интоксикацией и преобладанием синдромов поражения ЖКТ. В исследовании показано, что после проведения противогельминтной и восстановительной терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов с описторхозом происходит нормализация показателей Т-клеточного иммунитета абсолютного числа субпопуляций лимфоцитов — СD3+; CD4+; CD8+ клеток, при этом вирусная нагрузка РНК ВИЧ не повышается. Клинические случаи, представленные в данном наблюдении показывают положительный опыт проведения дегельминтизации у ВИЧ-инфицированных пациентов с клиническими симптомами паразитарной патологии, в частности при описторхозе, для восстановления их иммунного статуса.

Литература:

1. Успенский А. В. Современная ситуация по паразитам и меры борьбы с ними в России и странах СНГ (по материалам координационных отчетов). Эпизоотология, эпидемиология и мониторинг паразитарных болезней / А. В. Успенский, Е. И. Малахова, Т. А. Ершова // Российский паразитологический журнал. — 2014. — № 2. — С. 43–47.
2. Ο реализации постановления Главного государственного врача Российской Федерации от 12.12.2016 № 179 " Ο предупреждении распространения паразитов через рыбу и рыбную продукцию в Российской Федерации»// Письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей, М.,2018, № 01/12315–2018,27 с.
3. Шибитов С. К. Распространение и комплексная диагностика описторхоза непромысловых карповых рвб в Центральной России / С. К. Шибитов // Российский паразитологический журнал, 2019 — Т.13 (2) — С.36–43.
4. Мусыргалина Ф. Ф. Изучение зараженности рыб семейства карповые метацеркариями описторхид на реке Белой Республики Башкортостан /Ф. Ф. Мусыргалина, Т. Г. Кудакова // Общество XXI века: итоги, вызовы, перспективы.--2015--№ 4--С.3–6.
5. Ратникова Л. И. Описторхоз- актуальная инвазия Уральского региона/ Л. И. Ратникова, В. М. Борзунов// Известия высших учебных заведений Уральского региона.--2011--№ 2--С.87–90.
6. Беляева М. И. Оптимизация эпидемического надзора и санитарно-паразитологического мониторинга на разных территориях гиперэндемичного очага описторхоза/ М. И. Беляева // Медицинская наука и образование Урала. -2015.--Т.16, № 1 (81).-- С.110- 114.
7. Токмалаев, А. К. Клиническая паразитология — протоозы и гельминтозы: учебное пособие / А. К. Токмалаев, Г. М. Кожевникова. — 2–е изд. перераб. и доп. — Москва: МИА, 2017. — 385 с.
8. Чемидич Н. Д. Особенности описторхоза в природном очаге / Н. Д. Чемидич, Н. И. Ильина, В. В. Захлебаева [и др.]// Актуальная инфектология.--2014-- № 2(3).-- С.72–77.
9. Гаврилова, Е. П. Гельминтозы: общая характеристика, диагностика, лечение / Е. П. Гаврилова, Г. И. Кирпичникова, Н. И. Кузнецова // Российский семейный врач. — 2016. — № 4. — С.23–27.
10. Modjarrad К. HIV and helminths: time for a new direction / K.Modjarrad. Режим доступа: http://www.thelancet.com/journals/laninf/article/PIIS1473–3099(13)70239–1/abstract
11. Avgustinovich D.E A comparative stude of opistrorchis felineus (revolta 1884) infection in inbred c578l/6 and outbred CD–1 mice / D. E. Avgustinovich, A. V. Katokhin, G. V. Kontsevava [et al.] // Parazitology. — 2018. — Vol.52, № 1. — P.19–31
12. Симонов Р. О. Влияние гельминтозов на динамику иммунологического статуса больных с ВИЧ–инфекцией субклинической стадии/ Р. О. Симонов, Ш. В. Тимербулатов, Д. А. Валишин [и др.] // Медицинский вестник Башкортостана. — 2019. –Т.14, № 1 (79). — С.28–32.