Возрастная динамика свободнорадикальных процессов у самцов крыс при введении антиоксидантов и в условиях стресса



Исследованы особенности свободнорадикальных процессов в условиях иммобилизационного стресса, введения α-токоферола, эмоксипина и циклоферона, а также их сочетанного воздействия. В результате исследования установлено, что под действием иммобилизационного стресса происходит увеличение концентрации продуктов перекисного окисления липидов. Введение α-токоферола, эмоксипина и циклоферона способствовало существенному снижению уровня перекисного окисления липидов.

Ключевые слова: перекисное окисление липидов, α-токоферол, эмоксипин, иммобилизационный стресс.

Накопление продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях организма является одним из пусковых сигналов развития апоптоза. Известно, что старение организма сопровождается усилением свободнорадикальных процессов. С возрастом происходит снижение содержания витаминов–антиоксидантов в организме, что служит веским основанием для применения их в медицинской практике [1]. Эти вещества вызывают большой интерес, так как способны влиять на интенсивность апоптоза и свободнорадикальные процессы.

Целью нашего исследования является изучение особенностей возрастной динамики перекисного окисления липидов и определение роли витамина Е как соучастника многих метаболических реакций, протекающих в организме, а также выявить одновременно стресс-протекторные возможности антиоксидантов и их изменения в ходе возрастной инволюции.

Материал иметоды исследования

Опыты поставлены на базе совместной лаборатории по исследованию роли апоптоза в формировании нейроэндокринной системы Астраханского государственного университета.

Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении. Все эксперименты выполнены в весенний период.

Экспериментальный материал получен от двух серий опытов: I серия -молодые крысы (180дней) средней массой 103,5 г. (77 шт.), II серия опытов поставлена на старых крысах (820 дней) средней массой 215,2 г. (77 шт.). Различия по массе тела были достоверны

Экспериментальная модель — иммобилизационный стресс. Животных помещали в тесную пластиковую камеру, ограничивающую их движения, на 2 часа при комнатной температуре. По окончанию опытов крыс декапитировали после предварительной наркотизации внутрибрюшинным введением этаминала натрия (4 мг/ 100 г массы тела животного).

Животные получали α-токоферол, витамин С, эмоксипин и циклоферон в качестве антиоксидантов для проверки их антистрессорных свойств, антиоксидантных и антиапоптических качеств.

Животные были подразделены на экспериментальные группы.

Доза α-токоферола выбрана на основании данных об оптимальном действии витамина Е как антиоксиданта при разовом введении не более 2 мг/100 г. массы тела.

Доза эмоксипина подобрана экспериментально по сходному антиоксидантному действию α-токоферола в дозе 1мг/100г массы тела, т.к литературные данные не содержат сведений о терапевтических дозах для лабораторных животных.

Все экспериментальные данные обрабатывались статистически при помощи определения средней арифметической, её ошибки и достоверности различия между средними сравниваемых групп с помощью критерия t/p Стьюдента. Достоверным являлись отличия при уровне значимости р<0,05.

Определение уровня свободнорадикального окисления липидов втканях. Уровень свободнорадикального окисления (СРО) определяли по скорости перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях [8].

Определение перекисной резистентности эритроцитов. Для определения ПРЭ использовали методику, предложенную А. А. Покровским и А. А. Абраровым [6].

Результаты исследования иих обсуждение

Динамика концентрации МДА искорости ПОЛ вплазме крови ипечени при действии стресса иантиоксидантов

Системе антиоксидантной защиты организма принадлежит значительная роль в формировании физиологических и патологических процессов. С возрастом антиоксидантная защита организма ослабевает, за счет уменьшения содержания природных антиоксидантов и увеличению содержания «неактивных» молекул ферментов, разрушающих перекиси [13]. Усиление свободнорадикальных процессов и накопление окислительных повреждений биомолекул приводит к ускорению процессов естественного старения и преждевременному развитию болезней пожилого возраста [17].

По литературным данным, сведения о возрастной динамике ПОЛ противоречивы, что может быть связано с различными условиями проведения опытов и состоянием антиоксидантной системы организма.

В нашем исследовании у интактных старых животных исходный уровень МДА плазмы крови и печени значительно выше, чем у молодых крыс. Эта же закономерность характерна и для других показателей — скорости спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ. Сравнивая контрольные показатели ПОЛ, молодых и старых животных, можно сделать вывод, что у старых особей скорость спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ выше, чем у молодых (табл. 1, 2). Эти данные противоречат результатам исследований В. Н. Анисимова и др. (2008), согласно которым уровень антиоксидантов в печени с возрастом не претерпевает существенных изменений. Однако имеются литературные данные, доказывающие, что уровень ПОЛ увеличивается с возрастом [10, 12]. Различия в результатах исследований, возможно, связаны с разными условиями проведения эксперимента.

Таблица 1

Влияние иммобилизационного стресса иантиоксидантов на перекисное окисление липидов вплазме крови молодых истарых крыс

Характер воздействия	Уровень МДА
	Исходный уровень МДА, нмоль, ±m		Спонтанное ПОЛ, нмоль/час, ±m		Аскарбатзависимое ПОЛ, нмоль/час, ±m
	молодые	старые	молодые	старые	молодые	старые
Контроль	0,31±0,007 +++	0,38±0,005	2,11±0,021 +++	2,91±0,079	2,88±0,045 +++	3,92±0,123
Иммобилизационный стресс	0,42±0,014 *** +++	0,51±0,004 ***	2,82±0,119 ***++	3,34±0,132 *	3,62±0,149 *** ++	4,46±0,201 *
α-токоферол	0,29±0,010	0,30±0,006 ***	2,07±0,054 +++	2,37±0,008 ***	2,67±0,124 +	3,07±0,126 **
Стресс + α-токоферол	0,35±0,016 ## +++	0,42±0,009 ###	2,13±0,083 ### +++	2,96±0,114 #	2,92±0,048 ### +++	3,96±0,107 #
Витамин С	0,30±0,015	0,31±0,003 ***	2,08±0,044 +++	2,41±0,011 **	2,72±0,117 +	3,12±0,105 *
Стресс + витамин С	0,37±0.011 * ## +++	0,43±0,005 *, ###	2,15±0.054 ### +++	2,94±0,118 #	2,94±0,036 ### +++	3,97±0,087 #
Стресс + α-токоферол + витамин С	0,34±0.011 ## +++	0,39±0,012 ###	2,11±0,078 ### +++	2,89±0,075 ##	2,90±0,086 ### +++	3,88±0,113 #
Циклоферон	0,32±0,005	0,29±0,007 ***	2,05±0,038 +++	2,34±0,012 ***	2,75±0,101 +	3,11±0,094 **
Циклоферон + стресс	0,36±0,009 ## +++	0,41±0,011 ###	2,11±0,077 ### +++	2,92±0,094 #	2,97±0,041 ### +++	3,93±0,101 #
Эмоксипин	0,38±0,008 *** +	0,35±0,007 *	2,07±0,065 +++	2,76±0,068	2,94±0,051 ++	3,62±0,184
Стресс + эмоксипин	0,39±0,011 *** +++	0,45±0,003 ***, ###	2,59,±0,126 ** ++	3,11±0,107	3,41±0,124 ++	4,15±0,205

Примечание: *-р<0,05, **-р<0,01;***-р<0,001 достоверность различий в сравнении с контрольной группой

#- р<0,05, ##-р<0,01;###-р<0,001 — достоверность различий в сравнении с стрессированными животными

+- р<0,05, ++-р<0,01;+++-р<0,001 — достоверность различий в сравнении с старыми животными

±m — ошибка средней

Таблица 2

Влияние иммобилизационного стресса иантиоксидантов на перекисное окисление липидов впечени молодых истарых крыс

Характер воздействия	Уровень МДА
	Исходное содержание МДА нмоль МДА/0,5г ткани печени, ±m		Скорость спонтанного ПОЛ нмоль МДА/0,5г ткани печени, ±m		Скорость аскорбатзависимого ПОЛ нмоль МДА/0,5г ткани печени, ±m
	молодые	старые	молодые	старые	молодые	старые
Контроль	0,36±0,006 +++	0,57±0,013	2,14±0,051 +++	2,49±0,041	2,62±0,072 +++	3,03±0,081
Иммобилизационный стресс	0,48±0,008 ***+++	0,69±0,032 ***	2,43±0,082 **++	2,97±0,105 ***	3,12±0,101 ***++	3,82±0,165 ***
α-токоферол	0,34±0,011	0,34±0,026 ***	2,09±0,036	2,12±0,038 ***	2,49±0,036	2,68±0,094 **
Стресс + α-токоферол	0,39±0,009 ###+++	0,59±0,014 #	2,17±0,077 #++	2,53±0,054 ##	2,87±0,049 #+	3,11±0,097 ##
Витамин С	0,35±0,014	0,35±0,017 ***	2,11±0,023	2,14±0,019 ***	2,53±0,031	2,70±0,053 **
Стресс + витамин С	0,40±0,004 ###+++	0,58±0,009 #	2,19±0,059 #++	2,55±0,039 #	2,89±0,034 #+	3,15±0,074 ##
Стресс + α-токоферол + витамин С	0,36±0,007 ###+++	0,54±0,012 ##	2,15±0,044 #++	2,49±0,063 ##	2,79±0,053 ##+	2,91±0,083 ###
Циклоферон	0,33±0,008	0,31±0,018 ***	2,08±0,024	2,13±0,027 ***	2,51±0,043	2,67±0,053 **
Циклоферон + стресс	0,38±0,006 ###+++	0,57±0,007 #	2,18±0,059 #++	2,52±0,038 ##	2,85±0,033 #+	3,12±0,069 ##
Эмоксипин	0,42±0,005 ***+++	0,51±0,023 **	2,13±0,048 +++	2,43±0,036 **	2,79±0,063	2,84±0,074
Стресс + эмоксипин	0,47±0,008 ***+++	0,60±0,009 ##	2,34±0,071 *+++	2,88±0,057 ***	3,01±0,096 **++	3,56±0,123 **

Примечание: *-р<0,05, **-р<0,01;***-р<0,001 достоверность различий в сравнении с контрольной группой

#- р<0,05, ##-р<0,01;###-р<0,001 — достоверность различий в сравнении с стрессированными животными

+- р<0,05, ++-р<0,01;+++-р<0,001 — достоверность различий в сравнении с старыми животными

±m — ошибка средней

Исследование последних десятилетий указывают на усиление свободнорадикальных процессов при развитии стресса различной природы [3,11], что подтверждается и результатами наших исследований. Стрессорное воздействие приводит к напряжению и последующей декомпенсации механизмов антиоксидантной защиты. Такая реакция в разной степени характерна как для молодых, так и для старых животных. Результаты наших исследований показали, что под действием стресса увеличился исходный уровень МДА в плазме крови у животных обеих возрастных групп. Так же значительно вырос уровень спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ по сравнению с интактными животными. Данная закономерность стрессорного воздействия прослеживается и в увеличении скорости спонтанного, аскорбатзависимого ПОЛ и исходного уровня МДА в тканях печени у молодых и старых самцов крыс (табл.2,3).

Высокая антирадикальная активность α-токоферола объясняет эффективность его воздействия на интенсивность свободнорадикальных процессов. При взаимодействии молекулы α-токоферола с свободными радикалами и пероксидами образуется токоферилхинон и димеры α- токоферола, что приводит к прерыванию процессов ПОЛ [18]. Витамин Е оказывает более выраженный антиоксидантный эффект именно на стареющий организм. В наших экспериментах α-токоферол оказал характерное для него антиоксидантное действие — наблюдалось снижение уровня исходного МДА плазмы крови и печени у старых животных. У молодых грызунов наблюдалась тенденция к снижению данного показателя, что можно объяснить характерным для них более высоким уровнем эндогенных антиоксидантов и сбалансированностью системы про- и антиоксидантов, в отличие от старых, у которых уровень свободнорадикальных процессов повышен, и не компенсируется антиоксидантной системой. Аналогичная тенденция наблюдается и при введении животным витамина С и циклоферона.

При предварительном введении в рацион животных перед стрессированием α-токоферола, витамина С и циклоферона произошло снижение скорости спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ, а также исходного уровня МДА в плазме крови и печени у разновозрастных животных по сравнению с одним стрессорным воздействием (табл.2,3). Аналогичное введение α-токоферола в сочетании с витамином С привело к более выраженному антиоксидантному эффекту. Механизм этого эффекта связан, по-видимому, с тем, что взаимодействие витаминов Е и С повышает антиоксидантную активность одного витамина Е. Молекула α-токоферола эффективно взаимодействует с большинством активных форм кислорода и продуктами ПОЛ, находящихся в липидной фазе, образует малоактивный токоферольный радикал. Кроме того, обратное превращение α-токоферола осуществляется при участии водорастворимых антиоксидантов: аскорбиновой кислоты, глутатиона и др. Аскорбиновая кислота, восстанавливает α-токоферольный радикал, возвращая ему антиоксидантные свойства и обеспечивает перенос радикалов из гидрофобной фазы липидного бислоя в водную фазу [15].

В отличие от природного антиоксиданта α-токоферола, обладающего полифункциональным действием [4], предварительное введение эмоксипина стрессированным животным привело лишь к незначительному снижению исходного уровня МДА и кинетических показателей в плазме крови и печени у разновозрастных животных(табл.2,3). Причиной такого эффекта могло послужить различие в химическом строении и природе веществ. Фармацевтический препарат эмоксипин представляет собой соль органического происхождения. Имеются экспериментальные данные о том, что эмоксипин корректирует усиление свободнорадикального окисления в плазме крови и разных отделах центральной нервной системы в неодинаковой степени, таким образом можно полагать, что распространение этого препарата в тканях и органах организма происходит неравномерно [5]. Синтетический антиоксидант эмоксипин обладает слабо выраженным антиоксидантным и антиапоптическим эффектом у молодых и старых животных.

Увеличение интенсивности свободнорадикальных процессов в старости может приводить к росту уровня апоптоза клеток белой крови. Согласно взглядам ряда ученых, этот процесс может отличаться от физиологического апоптоза по биохимическим характеристикам [14,16].

Перекисная резистентность эритроцитов вусловиях стресса ивведения антиоксидантов

Эритроциты, как носители кислорода, имеют весьма высокий уровень активности антиоксидантных ферментов.

При старении в организме увеличивается продукция АФК, основной мишенью которой является мембрана эритроцитов. По данным литературы, при старении происходит увеличения уровня гемолиза эритроцитов [9].

В нашем исследование уровень перекисного гемолиза эритроцитов старых животных оказался значительно выше, чем у молодых, что свидетельствует об возрастном истощения антиоксидантной системы эритроцитов (табл. 3).

Таблица 3

Влияние иммобилизационного стресса иантиоксидантов на перекисный гемолиз эритроцитов крыс.

Характер воздействия	Гемолиз эритроцитов%, ±m
	молодые	старые
Контроль	4,38±0,259 +++	7,93±0,387
Иммобилизационный стресс	7,16±0,425 ***++	10,87±0,826 **
α-токоферол	4,42±0,158 +	5,04±0,243 ***
Стресс + α-токоферол	4,97±0,276 ###+++	8,21±0,615 #
Витамин С	4,46±0,147 +	4,89±0,197 ***
Циклоферон	4,39±0,0,227	5,97±0,328 **
Циклоферон + стресс	5,38±0,315 ##++	8,29±0,414 #
Стресс + витамин С	5,05±0,187 ###+++	8,35±0,577 #
Стресс + α-токоферол + витамин С	4,88±0,244 ###+++	8,02±0,598 #
Эмоксипин	4,81±0,236 +++	7,65±0,361
Стресс + эмоксипин	6,29±0,381 ***+++	9,13±0,411 *

Примечание: *-р<0,05, **-р<0,01;***-р<0,001 достоверность различий в сравнении с контрольной группой

#- р<0,05, ##-р<0,01;###-р<0,001 — достоверность различий в сравнении с стрессированными животными

+- р<0,05, ++-р<0,01;+++-р<0,001 — достоверность различий в сравнении с старыми животными

±m — ошибка средней

Установлено, что при развитии старческих изменений в организме, только СРО подвергаться регуляции различными антиоксидантами [2]. В наших исследованиях при добавлении к рациону животных α- токоферола, витамина С и циклоферона выявлены следующие закономерности: у старых животных произошло резкое уменьшение процента гемолизированных эритроцитов в сравнении с контролем, в то время как у молодых данный показатель несколько увеличился. Возможно, это связано с тем, что уровень мембранной защиты эритроцитов молодых животных вполне достаточен для устойчивости к действию пероксидов, а добавление избыточных концентраций α-токоферола привело к напряжению антиоксидантной системы эритроцитарных мембран. Колебание содержания α-токоферола как в сторону снижения, так и в сторону увеличения от оптимального уровня приводит к дестибализации мембран эритроцитов [9,17]. У старых животных с возрастом снижается антиоксидантная защита и проявляются антиоксидантные свойства α-токоферола, направленные на нормализацию оксидативного потенциала клеточных мембран.

При введении экспериментальным животным синтетического антиоксиданта эмоксипина произошло незначительное снижение процента гемолизированных эритроцитов у старых крыс по сравнению с контрольной группой, в то время как у молодых животных данный показатель повысился (табл.4).

В наших исследованиях при действии иммобилизационного стресса степень гемолиза эритроцитов возросла у молодых и старых животных в сравнении с контролем. Данная тенденция прослеживается и в работе З. Ж. Сейдахметовой и Г. К. Ташеновой [7], согласно которой иммобилизационный стресс вызывает усиление свободнорадикальных процессов, что приводит к снижению гемолитической стойкости эритроцитов.

Предварительное введение в рацион животных обеих возрастных групп α-токоферола, витамина С, циклоферона и комплекса «α-токоферол и витамин С» перед стрессированием привело к увеличению резистентности мембран эритроцитов к перекисной провокации. Аналогичное предварительное введение эмоксипина способствовало незначительному уменьшению процента гемолизированных эритроцитов в сравнении с воздействием только стресса и достоверному увеличению по сравнению с контрольной группой у молодых и старых крыс.

Выводы

1. Иммобилизационный стресс вызывают интенсификацию свободнорадикальных процессов в плазме крови и печени, одновременно резко усиливается гемолиз эритроцитов у самцов крыс вне зависимости от возраста.
2. В условиях иммобилизационного стресса α-токоферол, витамин С, циклоферон способствуют снижению уровня ПОЛ плазмы крови и печени, уменьшению интенсивности перекисного гемолиза эритроцитов лабораторных животных вне зависимости от возраста по сравнению с группой стрессированных, не получавших предварительно препараты. Таким образом, α-токоферол, витамин С и циклоферон проявляют стресс-протекторное действие.
3. В отличие от α-токоферола, витамина С и циклоферона, синтетический антиоксидант эмоксипин оказывает менее выраженный антиоксидантный эффект у молодых и старых мышей и крыс, что по-видимому, определяется различием химической структуры и, соответственно, свойств обоих антиоксидантов.

Литература:

1. Анисимов В. Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения: в 2 т.- 2 изд., перераб. и доп.- СПб.: Наука, 2008.- Т.1,2.- 481с., 434с.
2. Арутюнян А. В., Козина Л. С. Механизмы свободнорадикального окисления и его роль в старении // Успехи геронтол.- 2009.- Т. 22, № 1. — С. 104–116.
3. Барабой В. А. Стресс: природа, биологическая роль, механизмы, исходы.- К.: Фитосоциоцентр, 2006. — 424 с.
4. Зенков Н. К., Кандалинцева Н. В., Ланкин В. З. Фенольные биоантиоксиданты.- Новосибирск, 2003. — 328 с.
5. Мажитова М. В., Карибьянц М. А., Теплый Д. Л. Определение эмоксипина в биологическом материале с применением м-крезолфталексона sa // Естественные науки.-2011.- № 1.- С. 226–231.
6. Покровский, А.А., Абраров А. А. К вопросу о перекисной резистентности эритроцитов // Вопр.питания.- 1964.- № 6.- С.44–49.
7. Сейдахметова З. Ж., Ташенова Г. К. Влияние иммобилизационного стресса на реактивность симпато-адреналовой системыи резистентность эритроцитов у крыс в периоды маммо- и лактогенеза // Бюллетень со РАМН.- 2005.- Т118, № 4.-С. 93–95.
8. Строев Е. А., Макарова В. Г. Практикум по биологической химии. — М.: Высшая школа, 1986.- С. 211–214.
9. Теплый Д. Л. Нейрофизиологические эффекты витамина Е. Астрахань: ЛЕОН.- 2008.- 309с.

10. Aydin S. Gender-dependent oxidative variations in liver of aged rats//Biogerontology.- 2010.- Vol.11, № 3.-Р.335–346.

11. Chaturvedi P. Bitter melon protects against lipid peroxidation caused by immobilization stress in albino rats// Int J Vitam Nutr Res.- 2009.- Vol.79, № 1.-Р.48–56.

12. Gautam N., Das S., Mahapatra S. K. Age associated oxidative damage in lymphocytes //Oxid Med Cell Longev.- 2010.- Vol. 3, № 4.- Р. 275–282.

13. Honma T., Tsuduki T., Sugawara S. Aging decreases antioxidant effects and increases lipid peroxidation in the Apolipoprotein E deficient mouse //J Clin Biochem Nutr.- 2013.- Vol.52.-№ 3.-Р.234–240.

14. Kyaw M., Yoshizumi M., Tsuchiya K., et al. Atheroprotective effects of antioxidants through inhibition of mitogen- activated protein kinases // Аcta Pharmacol Sin.-2004.-Vol. 24, N8.-P.977–985.
15. Niki E. Role of vitamin E as a lipid-soluble peroxyl radical scavenger: in vitro and in vivo evidence// Free Radic Biol Med. — 2013., N5.-P.537–549

16. Pollack M., Phaneuf S., Dirks A., Leeuwenburgh C. The role of apoptosis in the normal aging brain, skeletal muscle, and heart // Ann N Y Acad Sci.- 2002. — N 959.-P. 93–107.

17. Teply D. L. Neurophisiological effects of vitamin E. Publishing House «Astrakhan University».- 2010.- р.310.

18. Thiagarajan R., Manikandan R. Antioxidants and cataract//Free Radic Res.- 2013.- Vol.47, № 5.- Р.337–345.