Роль жидкостной биопсии в диагностике и лечении опухолей



Жидкостная биопсия играет ключевую роль в понимании биологического механизма канцерогенеза. Этот метод исследования приобретает все большее значение, поскольку играет роль технического адъюванта в более рациональном подходе к лечению злокачественных новообразований, также он являются важным инструментом для диагностики на предсимптомных стадиях развития опухолей.

Ключевые слова: жидкостная биопсия, опухолевые заболевания, свободно циркулирующие опухолевые ДНК, циркулирующие опухолевые клетки, атипичные клетки, метастазирование, биомаркеры.

Liquid biopsy plays a key role in understanding the biological mechanism of carcinogenesis. This research method is becoming increasingly important because it plays the role of a technical adjuvant in a more rational approach to the diagnosis and subsequent treatment of malignant neoplasms, and it is also an important tool for pre-symptomatic diagnosis.

Key words: fluid biopsy, tumor diseases, free-circulating tumor DNA, circulating tumor cells, abnormal cells, metastasis, biomarkers.

Несмотря на некоторый прогресс в борьбе с злокачественными новообразованиями, победы ограничены. Современные методы очень хороши в лечении злокачественных опухолей in situ. Мы можем успешно искоренить первичные опухоли в тех местах, где они возникают, и эффективно контролировать местные рецидивы в близлежащих тканях. Тем не менее, отдаленное распространение атипичных клеток через кровоток, так называемое гематогенное метастазирование, всегда была роковой лазейкой в прогрессировании злокачественной опухоли. В литературе нет данных о времени начала этого процесса или его пути с точки зрения выявления метастазов в отдаленных местах, что говорит об ограниченности знаний в способности обнаружения и предсказания смертельного явления гематогенного распространения атипичных клеток.

Современным методом выявления гематогенного метастазирования является жидкостная биопсия, путем которой определяют ЦОК. ЦОК — клетки, которые способствуют распространению раковой опухоли, они находятся в кровотоке и, следовательно, должны быть найдены и изучены в образцах плазмы крови. Также в крови выявляются сцоДНК — свободно циркулирующая опухолевая ДНК, которая попадает туда в результате некроза, апоптоза, лизиса опухолевых клеток. У онкологических больных уровень их значительно увеличен. Другим преимуществом данного метода исследования является анализ различных генетических изменений, например точечные мутации. Анализ ЦОК и сцоДНК является одним из актуальных методов исследования метастазирования рака. Доказательством целесообразности данного метода является эксперимент, в котором участвовали пациенты с неметастатическим раком молочной железы, ЦОК было выявлены у 20,2 % пациентов. У ЦОК-положительных пациентов были увеличены размеры первичной опухоли, повышенное вовлечение лимфатических узлов, чем у ЦОК-отрицательных пациентов. Модели пропорциональных рисков, которые включали размер опухоли, вовлеченность региональных лимфатических узлов, размер первичной опухоли, а также гормональный рецептор и статус HER2 подтвердили, что наличие циркулирующих опухолевых клеток было независимым прогностическим фактором для выживания пациентов без рецидива заболевания. Таким образом, наличие ЦОК в плазме является предиктором низкой выживаемости [2].

Жидкостная биопсия позволяет проводить послеоперационное наблюдение минимальной остаточной болезни (МОБ) для обнаружения рецидива до диагностической визуализации или клинической симптоматики возможных метастазов. Однако число ЦОК и концентрация cцоДНК зачастую низки и требуют сверхчувствительных методов определения. Анализ проб жидкостной биопсии, взятых во время хирургической резекции из проксимальных дренирующих вен органов, поражённых опухолью, может способствовать выявлению пациентов, подверженных риску рецидива. Если в резецированной опухоли впервые выявлены кандидатные биомаркеры, динамическое определение профиля «ранних» ЦОК и/или сцоДНК может дать информацию о лечении рецидивирующего заболевания. Исследования кинетики МОБ также могут дать ценную информацию о биологии опухоли.

Биомаркером для диагностики являюстя геномные аберрации, экспрессия генов. При раке молочной железы атипичные клетки экспрессируют рецептор эстрогена (ESR1), онкоген HER2 и имунные регуляторы в ЦОК — PD-L1. PD-L1 — новые мишени, терапия которых приводит к длительной ремиссии у пациентов с запущенными злокачественными новообразованиями. Важно определить респондентов от лиц невосприимчивых к терапии, для этого необходимы прогностические биомаркеры. Посредством жидкостной биопсии определяются метастатические клетки, на которых экспрессируются PD-L1, циркулирующих в крови у пациентов с положительным рецептором эстрогена. Анализ ЦОК / PD-L1 может быть использован для жидкостной биопсии в клинике для стратификации и мониторинга больных раком.

Мутации в генах, кодирующих терапевтические мишени, и регулируемые ими эффекторы, могут влиять на эффективность химиотерапии. Пример: мутации EGFR при раке легких, мутация KRAS в ЦОК при колоректальном раке, мутации ESR и PIK3CA в сцоДНК и ЦОК при раке молочной железы — они тоже относятся к биомаркерам, выявленным методом жидкостной биопсии, определение которых влияет на выбор таргетной терапии.

Последовательный анализ ЦОК и сцоДНК может дать информацию об оптимальном времени изменения терапии. При меланоме секвенирование всего экзома (WES) и целевое секвенирование циркулирующей опухолевой ДНК позволяют отслеживать ответы на терапию и выявлять механизмы устойчивости. Секвенирование опухолей позволяют определить терапевтическую стратегию для BRAF мутаций и устойчивых к ингибиторам BRAF-мутантных опухолей, которые получают из образцов тканей, пораженных меланомой. Но анализ плазмы крови, методом жидкостной биопсии, позволяет определять мутации в циркулирующих опухолевых клетках, что служит альтернативой для биопсии, когда опухоли недоступны для данной манипуляции. Таким образом, жидкостная биопсия создает мощную технологическую платформу для персонализированной медицины у пациентов с меланомой.

У онкологических больных колоректальным раком анализ сцоДНК нужен для отслеживания клональной эволюции и приобретенной резистентности к EGFR — таргетной терапии [4]. Тем не менее, глубокому исследованию ЦОК мешает очень низкое количество этих клеток, в частности у пациентов с колоректальным раком. Создание клеточных культур и постоянных клеточных линий из ЦОК является одной из наиболее сложных задач в изучении опухолей. Клеточную линию, полученную из крови больного, исследователи культивировали более одного года, клетки были охарактеризованы на уровне генома, транскриптома, протеома. Тщательный анализ показал, что полученные клетки напоминают характеристики исходных опухолевых клеток со стабильный фенотипом у пациента с раком толстой кишки. Функциональные исследования показали, что эта культура быстро индуцировала образование эндотелиальных клеток in vitro и опухоли in vivo после ксенотрансплантации у мышей с иммунодефицитом. Опухолевые клетки, взятые у пациента, которые можно культивировать in vitro, являются необходимыми для оценки эффективности терапии в реальном времени [5].

Принципы жидкостной биопсии:

1. Идентификация новых генов, связанных с определенным типом опухоли.
2. Протеомный подход заключается в выявлении наиболее перспективных белковых мишеней (опухоли маркерные белки).
3. Системы обнаружения на основе антител наиболее широко используются для выявления опухолевых антигенов. Измерение антител к раку в крови имеет несколько преимуществ по сравнению с другими технологиями молекулярной диагностики, так как специфичные для рака антитела обнаруживается до появления опухолевых маркерных белков.

Помимо того, что сцоДНК выше в плазме крови у больных злокачественным новообразованием, содержание его коррелирует обратно пропорционально результату лечения, то есть имеет тенденцию падать с эффективным лечением. У многих больных раком мутантная ДНК является преобладающим подтипом. Плазменная ДНК представляет собой перспективную мишень для диагностического использования и потенциально может быть применена для выявления пациентов с высоким риском рецидива опухоли в отсутствие клинически выявляемых метастазов. Как источник злокачественной ДНК, плазма содержит потенциал информации о наличии остаточной метастатической болезни, напротив, другие жидкости организма содержат ДНК только из первичной опухоли. Выявление крайне низких концентраций ЦОК в крови все еще остается значимой проблемой.

Технология BEAMing для количественной оценки сцоДНК— цифровая технология, которая сочетает в себе эмульсионную цифровую ПЦР с магнитными шариками и проточной цитометрией — она позволяет количественно определять мутантную ДНК. Это неинвазивная, высокочувствительная «жидкостная биопсия» в режиме реального времени подходит для скрининга, прогнозирования и мониторинга рака. Ключевые особенности:

– Исходный материал: плазма, сыворотка или ткань (FFPE / замороженный)

– Исходное количество ДНК: ≥1 эквивалент генома (6,6 пг геномной ДНК человека)

– Способность к обнаружению: 0,01 % (мутант / общая ДНК) 1–4 (то есть, ≥1 мутантная ДНК молекула в 10000 молекул ДНК дикого типа)

– Срок результатов 2–4 дня [6]

Биочипы для выявления ЦОК. Микрофлюидное устройство CTC-Chip может захватывать эпителиальные ЦОК, которые адгезиюруются на поверхности чипа, покрытого антителами. В конструкции HB-Chip применяется пассивное смешивание клеток крови посредством генерации микровихрей, чтобы значительно увеличить количество взаимодействий между ЦОК и поверхностью чипа, покрытого антителами. Эффективный захват клеток был подтвержден с использованием определенного количества раковых клеток в экспериментальной крови, и клиническая полезность была продемонстрирована в образцах от пациентов с раком простаты. ЦОК были обнаружены у 93 % пациентов с метастазами, а опухолеспецифическая транслокация TMPRSS2-ERG была легко идентифицирована после выделения РНК и анализа ОТ-ПЦР. CellSearch (Veridex) в настоящее время является единственным устройством, одобренным FDA для отслеживания прогрессирования рака. Оно захватывает ЦОК на основе их сродства к антителам EpCAM. С помощью него исследователи показали, что количество ЦОК является хорошим предиктором выживаемости или прогрессирования заболевания у людей с метастатическим раком молочной железы, толстой кишки и раком простаты. Недостаток данного устройства заключается в том, что выход клеток в кровоток очень низкий.

Система CellTracks (Janssen Diagnostics) представляет собой автоматизированную систему для иммунного захвата клеток и флуоресцентного окрашивания клеток, устройство включает в себя полуавтоматический флуоресцентный микроскоп, который используется для подсчета и характеристики клеток на основе сигналов флуоресценции. Обнаружение ЦОК с использованием иммунного захвата до начала терапии у пациентов с метастатическим раком молочной железы высоко предсказывает выживаемость без прогрессирования (PFS) и общую выживаемость. Увеличение количества циркулирующих эндотелиальных клеток наблюдается в периферической крови больных раком, что может способствовать росту опухоли в процессе ангиогенеза. Характеристика этих клеток путем изучения профилей экспрессии генов иммуномагнитно обогащенные ЦОК могут предоставить биомаркеры для оценки эффективности лечения. Эта технология может помочь в разработке индивидуальной процедуры лечения.

Нано-технология для захвата ЦОК. Большинство клеток повреждается во время захвата, к тому же их количество чрезвычайно мало, поэтому их трудно выделить из других клеток в крови. Данный метод был разработан для количественной оценки ЦОК, принцип которого основан на захвате опухолевых клеток. Тем не менее, просто захватить атипичную клетку недостаточно, её надо проанализировать против группы раковых биомаркеров, оставляя её неповрежденной для секвенирования генома. Устройство состоит из кремниевой нанопроволоки, которые покрыты антителами, связывающимися с белком, на наружной мембране атипичных клеток называемые EpCAM (Wang et al. 2009). Улучшить при этом высвобождение клеток удалось путем добавления чувствительного к температуре полимера к кремниевые нанопроволоки. При 37 ° C анти-EpCAM полимеры захватывают опухолевые клетки, а при 4 ° С они выпускают их. В результате ~ 90 % высвобожденных клеток не имеют повреждений.

Редкие ЦОК, присутствующие в кровотоке у пациентов с злокачественными новообразованиями, потенциально доступный источник для обнаружения, характеристики и мониторинга опухолей. Совершенствование методики выделения опухолевых клеток в крови и их характеристика может стать мощным диагностическим инструментом, способствующим развитию раннего выявления локализации опухоли, выбора терапии и её контроля.

Литература:

1. Characterization of circulating tumor cell aggregates identified in patients with epithelial tumors / E. H. Cho [and other] // Physical Biology. — 2012. — V.9. — № 1. — Р. 1–10.
2. Alix-Panabieres C. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy / C. Alix-Panabieres, K. Pantel // Cancer discovery. — 2016. — V.6. — № 5. — Р. 479–491.
3. Frequent expression of PD-L1 on circulating breast cancer cells. M. Mazel [and oter] // Molecular Oncology. — 2015. — V.9. — № 9. — Р. 1773–1782.
4. Siravegna G. Blood circulating tumor DNA for non-invasive genotyping of colon cancer patients / G. Siravegna, A. Bardelli // Molecular Oncology. — 2016. — V.10. № 3. — P. 475–480.
5. Establishment and Characterization of a Cell Line from Human Circulating Colon Cancer Cells/ L. Cayrefourcq [and other] // Cancer Research. 2017. — V.75. — № 5. — P. 892–901.
6. Nasoethmoidal Intestinal‐Type Adenocarcinoma Treated with Cetuximab: Role of Liquid Biopsy and BEAMing in Predicting Response to Anti‐Epidermal Growth Factor Receptor Therapy / S. Cabezas-Camarero [and other] // The Oncologist. — 2019. — V.24. — P. 1–8.