Различные типы секвенирования ДНК | Статья в журнале «Молодой ученый»

Отправьте статью сегодня! Журнал выйдет 5 февраля, печатный экземпляр отправим 9 февраля.

Опубликовать статью в журнале

Рубрика: На правах рекламы

Опубликовано в Молодой учёный №20 (206) май 2018 г.

Дата публикации: 04.05.2021

Статья просмотрена: 8 раз

Библиографическое описание:

None

С момента зарождения секвенирования в 1970-х некоторые методы вымерли, а некоторые эволюционировали и сегодня стали методами, которые выбирают многие исследователи, стремящиеся понять генетические вариации.

Секвенирование по Сэнгеру

Секвенирование по Сэнгеру применяется при проведении низкопроизводительного, целевого или короткого секвенирования. Благодаря своей чувствительности и относительной простоте в плане рабочего процесса и техники, данная методика остается золотым стандартом в технологии секвенирования и используется в различных областях, от целевого секвенирования до подтверждения вариантов, выявленных ортогональными методами.

В секвенировании по Сэнгеру используется метод терминации цепи для определения идентичности и порядка нуклеотидных оснований в данной нити ДНК. В этом методе используются химические аналоги четырех нуклеотидных оснований. В этих аналогах, называемых дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP), отсутствует гидроксильная группа, необходимая для удлинения полинуклеотидных цепей, образующих молекулу ДНК. При смешивании радиоактивно-меченых дидезоксинуклеозидтрифосфатов с шаблонной ДНК образуются нити любой возможной длины, в которых меченые ddNTP встраиваются и завершают цепь.

К середине 1990-х годов исследователи проводили секвенирование по Сэнгеру с помощью капиллярного электрофореза. В этой технологии меченые фрагменты ДНК разделяются по размеру в длинных тонких капиллярах из акрилового волокна, заполненных гелевой матрицей. Образец, содержащий меченые фрагменты, электрокинетически вводится в капилляр, и движется под действием электрического поля. Проходя через детекторующий лазер внутри прибора, метки обнаруживаются, и последовательность определяется. Одним из самых популярных приборов для секвенирования по Сэнгеру сегодня является генетический анализатор Applied Biosystems 3500.

Капиллярный электрофорез и фрагментный анализ

Приборы для капиллярного электрофореза (КЭ) способны выполнять как секвенирование по Сэнгеру, так и фрагментный анализ. Фрагментный анализ - это метод, при котором фрагменты ДНК флуоресцентно маркируются, разделяются с помощью КЭ и определяются по размеру путем сравнения с внутренним стандартом. Хотя секвенирование ДНК с помощью КЭ используется для определения конкретной последовательности оснований определенного фрагмента или сегмента гена, этот метод также позволяет получить размер, относительное количество и информацию о генотипировании для флуоресцентно меченых фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР с использованием праймеров, предназначенных для конкретной ДНК-мишени.

Анализ фрагментов ДНК позволяет решать различные задачи - от аутентификации клеточных линий до выявления анеуплоидии. Хотя методы секвенирования также позволяют решать эти задачи, исследователи выбирают фрагментный анализ, поскольку он имеет более быстрое время выполнения, более высокую чувствительность и разрешение, а также является более экономичным.

Секвенирование следующего поколения (NGS)

Хотя за прошедшие годы в секвенирование по Сэнгеру был внесен ряд усовершенствований, появились и новые высокопроизводительные методы, получившие название технологий секвенирования следующего поколения (NGS). NGS проводится в массивно-параллельном режиме.

Спектр анализа NGS может простираться от небольшого количества генов до целого генома, в зависимости от цели. Цельногеномное секвенирование (WGS) и цельноэкзомное секвенирование (WES) позволяют получить последовательность оснований ДНК в геноме и экзоме соответственно. Секвенирование цельного транскриптома предоставляет информацию о последовательности кодирующих и многочисленных некодирующих форм РНК для оценки вариаций и уровней экспрессии генов во всем транскриптоме. Целевое секвенирование охватывает относительно небольшой набор генов или целевых регионов, представляющих интерес. Быстрое время выполнения, низкая стоимость, низкая потребность в образцах и относительная простота интерпретации делают целевое секвенирование особенно подходящим для трансляционных и клинических исследований. Для подтверждения вариантов, выявленных с помощью NGS, часто используется секвенирование по методу Сэнгера.

Секвенирование по Сэнгеру, фрагментный анализ и NGS позволяют использовать множество новейших технологий, которые способствуют углублению научного понимания геномов.

По материалам сайта www.laboratorii.com

Основные термины (генерируются автоматически): NGS, фрагментный анализ, капиллярный электрофорез, WES, WGS, быстрое время выполнения, меченый фрагмент ДНК, подтверждение вариантов, помощь.


Задать вопрос