Автор: Худяков Андрей Николаевич

Рубрика: Медицина

Опубликовано в Молодой учёный №8 (19) август 2010 г.

Статья просмотрена: 38 раз

Библиографическое описание:

Худяков А. Н. Возможность сохранения функций лейкоцитов крови при температуре –80°с под защитой различных криозащитных сред // Молодой ученый. — 2010. — №8. Т. 2. — С. 206-209.

Большинство клеток высших растений и животных в процессе эволюции не приобрели естественных механизмов адаптации к холоду. В связи с чем, при воздействии низких температур нуждаются в наличии средств «искусственной» защиты. Для сохранения клеток крови, в том числе лейкоцитов, используют большой спектр криофилактиков, которые делят на проникающие и непроникающие. В их число входят вещества различной химической природы. К проникающим в клетку относятся глицерин, диметилсульфоксид – ДМСО, диметилацетамид – ДМАЦ, 1,2-пропандиол – 1,2-ПД. Непроникающие – это поливинилпирролидон – ПВП, полиэтиленоксид – ПЭО-1500 и более высоких молекулярных масс, гидроксиэтилкрахмал – ГЭК. Защитное действие внутриклеточных криофилактиков выражается в том, что, обладая низкой молекулярной массой, эти вещества легко проникают в клетку, связывают воду, способствуют переохлаждению клеток, изменяют кристаллообразование, стимулируя образование преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании. Кроме того, являясь хорошими растворителями, они снижают концентрацию солей внутри и вне клеток, этим самым, предохраняя их от обезвоживания и уменьшая повреждение белковых структур клеток. Также эти вещества образуют связи со структурными компонентами мембраны клеток, что ведет к снижению степени ее повреждения при замораживании [1, 2, 6]. Механизм действия непроникающих криопротекторов основан на их способности образовывать прочные связи с внеклеточной водой, замедлять скорость образования кристаллов и изменять их структуру, взаимодействовать с мембраной клеток, следствием чего является повышение ее устойчивости к повреждающему действию кристаллов [2, 5].

На сегодняшний день состав криоконсервирующих растворов весьма вариабелен, так как различные по своей природе клетки по-разному переносят замораживание. Как показывают исследования [9, 10, 11, 14], наилучшие результаты получают при использовании комбинированных, т.е. растворов, содержащих как проникающие, так и непроникающие криопротекторы.

В рамках данной работы изучалась эффективность применения новых хладоограждающих растворов для сохранности морфофункциональных показателей ядерных клеток крови человека, замороженных по экспоненциальной программе и хранившихся при температуре –80°С в течение одних суток.


Объектом исследования служил концентрат лейкоцитов, выделенный из цельной крови доноров-добровольцев путем цитафереза («Sorvall», США). Для введения ядерных клеток крови в состояние холодового анабиоза –80°С были использованы два хладоограждающих раствора. Ингредиентами первого раствора явились: криопротектор смешанного действия – гексаметиленбистетрагидроксиэтилмочевина, криопротектор проникающего действия – ДМСО и антиоксидант – сукцинат гидроксиметилэтилпиридина. В состав второго раствора вошли следующие ингредиенты: криопротектор проникающего действия – 1,2-ПД, криопротектор непроникающего действия – ГЭК, «реставрирующая» добавка с антигипоксическим действием – «Реамберин». Проведено более 500 тестирований. Среднее  количество  биообъекта составляло 22,7±6,1 мл. Лейкоциты смешивали в соотношении 1:1 с одним из хладоограждающих растворов в пластикатном контейнере «Компопласт 300» и выдерживали в течение 20 мин при комнатной температуре. Замораживание клеток производили по двухступенчатой экспоненциальной программе (на 1-м этапе со скоростью 10°/мин до точки эвтектики (–4,8°С), на 2-м – 1-2°/мин до температуры –80°С). (Рис. 1)

Рис.1. Экспоненциальная программа замораживания лейкоцитов до –80ºС.

После замораживания объекта до названной температуры контейнеры с клетками переносили в электроморозильник на –80°С («Sanyo», Япония) для хранения. Быстрый отогрев биообъекта производили через одни сутки при замораживании с первым раствором и через одни сутки – со вторым в 20-литровой водяной ванне, нагретой до +38°С, в течение 30-45 сек (в зависимости от объема биообъекта) при интенсивном покачивании  контейнера (3-4 раза в секунду) до температуры биообъекта +2 ÷ +4°С.

До замораживания и в первые минуты после отогрева проводили оценку функциональных свойств лейкоцитов. Определяли  целостность клеточных мембран по методу Шрека с использованием суправитального красителя эозина [13]; морфологический состав лейкоконцентрата по данным лейкоформулы; степень активации мембраносвязанной NADPН-оксидазы нейтрофилов с помощью регистрации супероксидного анион-радикала в НСТ-тесте [4]; содержание соединений, обеспечивающих микробицидность нейтрофилов без участия кислорода (дефензины, серпроцидины, кателицидин), в гранулах нейтрофилов, с помощью лизосомально-катионного теста (ЛКБ-тест) по методике А.А. Славинского и Г.В. Никитиной [8], содержание Т- и В-лимфоцитов с помощью моноклональных антител; фагоцитарную активность нейтрофилов с использованием инертных частиц латекса [7], а также с помощью регистрации кинетической кривой спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) с определением на ней максимальных интенсивностей основных пиков и времени их наступления в секундах. Измерения проводились на биохемилюминометре БХЛ-07 (ЦНИЛ НГМА; «ИМБИО», Россия);

Полученные данные обрабатывали статистически: вычисляли среднее арифметическое значение, среднее квадратичное отклонение. Достоверность различия между показателями оценивали по критерию Уилкоксона. Результаты считали достоверными при p < 0,05 [3].

При замораживании биообъекта с хладоограждающим раствором I (n=12) установлено, что сохранность общего количества лейкоцитов составила 96,8±4,3% (от исходного уровня), жизнеспособность – 90,9±7,1%, количество гранулоцитов – 94,5±6,9%. Сохранность лимфоцитов и моноцитов во всех опытах была равнозначно высокой, что обусловлено хорошей устойчивостью данных видов лейкоцитов к процессам замораживания-отогрева [12]. Количество лизосомально-катионных белков достоверно (p<0,05) не отличалось от исходного уровня. По данным НСТ-теста наблюдалось достоверное (p<0,05) увеличение процента активированных нейтрофилов после отогрева в 4 раза. При изучении субпопуляций лимфоцитов установлено, что количество Т- и В-лимфоцитов в размороженных образцах через одни сутки хранения при –80°С достоверно не изменялось по сравнению с данными до замораживания.

При замораживании биообъекта до –80°С с хладоограждающим раствором II (n=11) установлено, что через одни сутки холодового анабиоза сохранность общего количества лейкоцитов составила 93,7±4,8% (от исходного уровня) с жизнеспособностью 87,0±7,6%. Количество гранулоцитов достоверно снизилось до 68,2±12,7%. Сохранность лимфоцитов и моноцитов во всех опытах была также равнозначно высокой. Кислородзависимая микробицидность нейтрофилов (НСТ-тест) после отогрева  увеличивается в 3 раза, а количество лизосомально-катионных белков в нейтрофилах остается на прежнем уровне.

При оценке начальной стадии фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) показано, что у нативных лейкоцитов первый пик ЛХЛ регистрируется в среднем на 300 сек с максимальной интенсивностью 163,2±51,3 мВ (адгезия клеток), второй пик – в среднем на 500 сек с максимальной интенсивностью 360,5±50,4 мВ (ответ, вызванный опсонизацией, сопровождается повышением уровня метаболической активности). Следующий этап фагоцитоза исследовали по поглощению нейтрофилами инертных частиц латекса. Установлено, что фагоцитарная активность нативных нейтрофилов составляла 62,3±9,7%.

После смешивания и экспонирования лейкоцитов с любым вариантом хладоограждающего раствора регистрируется в большинстве случаев только один пик ЛХЛ, по интенсивности уступающий в 15 раз нативным клеткам.

Через 1 сутки холодового анабиоза при –80°С c применением обоих растворов ЛХЛ лейкоцитов регистрируется в виде одного пика и составляет 3,5±1,1 мВ, что достоверно ниже в сравнении с уровнем до замораживания. Такое резкое падение интенсивности хемилюминесценции обусловлено особенностями компонентов, входящих в состав растворов, в частности, криопротекторов, которые выступают в роли ингибиторов свечения и нарушают цепь реакций активных кислородных метаболитов с люминолом. При оценке ФАН после отогрева наблюдается сохранность 78,1±5,9% (от исходного уровня) клеток с поглощёнными частицами латекса при использовании раствора I, что достоверно (p>0,05) выше данного показателя при использовании раствора II, где их количество составляет 57,3±5,9%.

Таким образом, из двух представленных хладоограждающих растворов лучшими криозащитными свойствами обладает раствор I, позволяющий сохранить на высоком уровне морфофункциональные показатели ядерных клеток крови человека, замороженных по экспоненциальной программе и хранившихся при температуре –80°С в течение одних суток.

Лабиринт

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант 08-04-01423.

 

Библиографический список:

1.      Белоус А.М., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев: Наукова думка, 1982. – 256 с.

2.      Белоус А. М., Грищенко В.И. Криобиология. Киев: Наукова думка, 1994. – 430 с.

3.      Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998. – 459 с.

4.      Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: Изд-во Томского гос. ун-та, 1992. – С. 224-226.

5.      Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. Киев: Наукова думка, 1994. – 143 с.

6.      Левин С.В. Структурные изменения клеточных мембран. Л.: Наука, 1976. – 197 с.

7.      Потапова С.Г., Хрустиков В.С., Демидова Н.В. и др. Изучение поглотительной способности нейтрофилов крови с использованием инертных частиц латекса // Пробл. гематологии и переливания крови, 1977. – №9. – С. 58-59.

8.      Славинский А.А., Никитина Г.В. Цитохимическое выявление катионных белков в гранулоцитах крови амидо-черным 10Б для визуальной оценки и компьютерного анализа изображения // Клиническая лабораторная диагностика, 1999. – №2. – С. 35-37.

9.      Celluzzi C.M. Welbon C. A simple cryopreservation method for dendritic cells and cells used in their derivation and functional assessment // Transfusion, 2003. – Apr. 43, №4. – P. 488-494.

10.  Crowley J.P., Rene A., Valeri C.R. The recovery, structure, and function of human blood leukocytes after freeze-preservation // Cryobiology, 1974. – Vol. 11. – Р. 395-409.

Лабиринт

11.  Feldmann C.  Einfluß von Kühlrate und Kryoprotektivzusammensetzung auf die durchflußzytometrische Analyse fon Oberflächenantigenen kryokonservierterperipherer hämatopoetischer Progenitorzellen // Hämotology, 2002. – № 28. – S. 90-115.

12.  Simon J.D. Recovery of human T- and B-lymphocytes frozen at –80°C / J.D. Simon, M.M. Albala, L.J. Flinton // Cryobiology. – 1975. – Vol. 12., № 6. – P. 536–542.

13.  Shreck R. A method for counting the viable cells in normal and malignant cell suspension // Ann. J. Cancer, 1936. – Vol.28 – P.389-391.

14.  Stiff P.J., Murgo J.A., Zarolus C.G. Unfractionated human marrow cells cryopreservation using dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch // Cryobiology, 1987. – Vol. 20. – P. 17-24.

Основные термины (генерируются автоматически): клеток крови, ядерных клеток крови, инертных частиц латекса, клеток крови человека, исходного уровня, лейкоцитов крови, общего количества лейкоцитов, Похожая статья, экспоненциальной программе, сутки холодового анабиоза, сохранность общего количества, сохранения клеток крови, замораживании биообъекта, использованием инертных частиц, температуре –80°С, функций лейкоцитов крови, растворов ЛХЛ лейкоцитов, активность лейкоцитов крови, использовании раствора, микробицидность нейтрофилов.

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle
Задать вопрос