Динамика изменения размеров фосфатидилхолиновых липосом с липоевой кислотой, находящихся в плазме крови человека, обедненной тромбоцитами | Статья в журнале «Молодой ученый»

Отправьте статью сегодня! Журнал выйдет 6 июля, печатный экземпляр отправим 10 июля.

Опубликовать статью в журнале

Библиографическое описание:

Щелконогов В. А., Баранова О. А., Чеканов А. В., Казаринов К. Д., Соловьева Э. Ю., Сорокоумова Г. М. Динамика изменения размеров фосфатидилхолиновых липосом с липоевой кислотой, находящихся в плазме крови человека, обедненной тромбоцитами // Молодой ученый. — 2017. — №41. — С. 17-25. — URL https://moluch.ru/archive/175/45938/ (дата обращения: 25.06.2019).



Оценена динамика изменения «пустых» фосфатидилхолиновых (ФХ) липосом и липосом с α-липоевой кислотой при длительном хранении (в течение 18 месяцев) при Т = +4 0С. Изучено взаимодействие липосомальных нанокнструкций с компонентами плазмы здоровых доноров и пациентов, перенёсших острый ишемический инсульт. Методом динамического светорассеяния (ДРС) показано, что инкубирование в течение 4 часов липосомальной формы ЛК в плазме крови здоровых доноров не приводит к изменению размеров диаметров липосом.

Ключевые слова: липосомы, α-липоевая кислота, динамическое светорассеяние, плазма

Введение

Применение липосом в качестве систем доставки лекарств в наше время является перспективным подходом к повышению эффективности лечения. Включение лекарств в состав липосом способствует повышению биологической активности, биодоступности инкапсулированного препарата, а также позволяет увеличить терапевтический индекс (соотношение терапевтического эффекта и токсичности) лекарства [1]. В основном в медицинской практике применяется внутривенное введение липосомальных препаратов [2]. Поэтому необходимо иметь подробную информацию об их взаимодействии с различными компонентами плазмы крови липопротеиновыми комплексами и клетками крови.

Целью данной работы является исследование временной динамики изменения размеров липосом, содержащих липоевую кислоту в плазме крови, в течение недели после забора крови у здоровых доноров и пациентов, перенесших ишемический инсульт, с помощью методов динамического светорассеяния.

Материалы иметоды.

В работе использовали фосфатидилхолин Lipoid S-100 94 % чистоты, выделенный из бобов сои («Lipoid GmbH», Германия), α-липоевую кислоту (± α-Lipoic аcid, «Sigma–Aldrich», США), фосфатидилхолиновые липосомы с α-липоевой кислотой (содержащие α-липоевую кислоту), полученные на кафедре БТиПФ Московского технологического университета (МИТХТ). Для взятия венозной крови использовали стандартные пробирки (V=4,5мл) с антикоагулянтом цитратом натрия 3,2 % Vacuette®, кат. № 454329 (Австрия). Плазму крови, обедненную тромбоцитами, получали с использованием мульти центрифуги СМ-6МТ ELMI (Латвия). Для измерения рН среды физиологического раствора использовали pH-метр-милливольтметр pH-150 «РИАП» (Россия) и Sartorius PB-11. Для определения размеров полученных липосом и оценки их взаимодействия с компонентам плазмы методом динамического светорассеяния использовали анализатор размеров частиц и дзета-потенциала частиц и плоских поверхностей Delsa Nano C, Beckman Coulter Inc (США). и. Для измерения вязкости плазмы использовали в вибрационный вискозиметр SV-1A(«A&D Company Limited», Япония).

Измерение размеров липосомальных наночастиц методом динамического светорассеивания.

В программе прибора DelsaNano C, установленной на компьютере, задавали следующие параметры:

1) Параметры измерения (Measurement parameters). Выбирали MeasurementCond 100 (для измерения мелких стабильных наночастиц), (Repetition) 4 повтора.

2) Параметры анализа (Analysis parameters). Выбирали NNLS (обработка данных с помощью метода наименьших квадратов).

3) Параметры ячейки (Cell parameters). Выбирали Size call glass 1500 (т к. использовали кювету с V=1,5 мл)

4) Свойства растворителя (Diluent properties). В качестве среды, в которой проводились измерения размеров НЧ, использовали воду со следующими (физическо-химическими) параметрами: Т= 25 0С, вязкость — 0,89 Па*сек., коэффициент преломления — 1,33, диэлектрическая проницаемость — 78,3.

Полученные образцы липосом растворяли в физиологическом растворе (V=960 мкл, рН = 6,5) в 25 раз, после чего проводили измерения размеров частиц на приборе Delsa Nano C, Beckman Coulter Inc. (США) при Т = 25 0С.

Подготовка образцов крови.

Эксперименты проводили in vitro на образцах крови, взятых у здоровых доноров и у пациентов, перенесших ОНМК. У всех участников было получено добровольное согласие на взятие биоматериала. Обедненную тромбоцитами плазму (ОТП) получали центрифугированием крови в течение 25 мин. при 840 g., при комнатной температуре.

Измерение динамики изменения размеров липосом с липоевой кислотой в плазме методом динамического светорассеивания.

Метод определения размера липосом заключался в следующем. Наливали в прозрачную пластиковую кювету 1 мл обедненной тромбоцитами плазмы (БТП) и помещали в вибрационный вискозиметр SV-1A («A&D Company Limited», Япония). При использовании термостата в режиме 37 0С вязкость БТП = 1,53 Па*сек. Для каждого образца данную процедуру повторяли 3 раза. После чего исследуемый образец ставили в кюветное отделение анализатора размера наночастиц, Delsa Nano C, (Beckman Coulter Inc., США), включали термостат (Т = 37 0С) и регистрировали распределение размеров компонентов плазы по интенсивности в течение 4-ех часов. К исследуемым образцам с обедненной тромбоцитами плазмы (V = 960 мкл) добавляли «пустые» фосфатидилхолиновые липосомы или липосомы с липоевой кислотой (V = 40 мкл), перемешивали и аналогичным образом регистрировали динамику изменения размеров наночастиц, при инкубировании их в плазме крови (Т = 37 0С) в течение 4-ех часов.

Результаты иобсуждение.

Ранее на кафедре БТиПФ Московского технологического университета (МИТХТ) были получены липосомы с α-липоевой кислотой (α-ЛК), характеризующиеся эффективностью включения субстанции равной 85 % и обладающие пролонгированным действием. Также было оценено эффективное влияние липосомальной формы липоевой кислоты на агрегацию тромбоцитов как у здоровых доноров, так и у пациентов, перенёсших ишемический инсульт [3, 4].

В настоящей работе оценивалась стабильность липосом с α-ЛК и «пустых» фосфатидилхолиновых липосом при длительном хранении при Т = +4 0С (в течение 18 месяцев) и динамика изменения размеров липосомальных препаратов при инкубировании их в плазме крови здоровых доноров и пациентов, перенёсших ишемический инсульт (Т= 37 0С) в течение 4-ех часов.

Динамика изменения фосфатидилхолиновых липосом с липоевой кислотой при хранении в течение длительного времени при Т = +4 0С

На первом этапе работы определялась динамика изменения размеров «пустых» фосфатидилхолиновых (ФХ) липосом или липосом с α-ЛК в физиологическом растворе (рН=6,5) при хранении в течение длительного времени (9 и 18 месяцев) при Т = +4 0С. Размеры частиц определяли методом динамического светорассеивания (ДРС). В ходе работы были получены следующие результаты, представленные на рис.1.

Рис.1. Распределение размеров наночастиц от интенсивности светорассеяния в физиологическом растворе (рН=6,4): «пустых» фосфатидилхолиновых липосом (A), через 9 месяцев (B), через 18 месяцев (С); липосом, содержащих ЛК (D), через 9 месяцев (E), через 18 месяцев (F)

В результате проведенных исследований было обнаружено, что размеры «пустых» ФХ липосом, за время хранения (9 месяцев) значительно увеличились. В образце содержалось несколько фракций частиц, 65 % частиц имели размер более 1 мкм: 1,3 мкм (15 %) и 2,3 мкм (50 %) (Рис. 1 A, B). При хранении «пустых» ФХ липосом в течение 18 месяцев происходило уменьшение количества фракций с маленькими наночастицами (НЧ) 65 нм (5 %), 380 нм (30 %) и увеличение образования более крупных агрегатов, включающие фракции с размерами частиц до 2 микрон (20 %) и до 23 микрон (45 %) (Рис. 1, С).

Изменения же размеров частиц липосом с α-ЛК не происходило. Данные наночастицы после хранения при Т = +4 0С в течение 9 и 18 месяцев представляли собой однородную систему с размером частиц 130 нм (Рис. 1, D, Eи F).

Эти результаты можно объяснить тем, что липоевая кислота, по-видимому, стабилизирует липосомы за счет её взаимодействия с поверхностью мембраны (ФХ) и изменения её поверхностного заряда. И при этом наночастицы с α-ЛК не агрегируют между собой.

Исследование взаимодействия липосом, содержащих α-липоевую кислоту, с компонентами плазмы крови человека.

Плазма крови представляет с собой сложную, многокомпонентную биологическую систему, состоящую из различных органических (белки, белок-липидные комплексы, липопротеины, хиломикроны и др.) и неорганических (катионы: Na+, K+, Ca2+, Mg2+; анионы: Cl-, HCO3-, HPO42- и др.) соединений с разными размерами (Таблица 1). В отличие от сыворотки крови, в которой процессы деградации белков и их агрегации, обеспечивающие свертывание крови уже прошли, в плазме крови эти процессы ингибированы благодаря действию антикоагулянтов (например, гепарина). Однако замедление этих процессов не гарантирует отсутствия их влияния на структуры и концентрации молекул белков и их комплексов в плазме крови [5, 6].

Таблица 1

Основные классы липопротеинов вплазме крови человека [6].

Следовательно, необходимо учитывать, что, попадая в плазму крови, липосомы могут взаимодействовать со всеми ее компонентами, что приводит к изменению размеров, морфологии данных наночастиц и их свойств [7, 8]. Такой процесс может происходить в следующих направлениях. Во-первых, механическое налипание молекул белков плазмы на поверхность липосомы могут увеличивать ее средний гидродинамический диаметр. Во-вторых, эти же компоненты плазмы, находясь в контакте, друг с другом и «сжимая» липосому, могут деформировать липидный бислой частицы тем самым, уменьшая ее размер.

Поэтому на данном этапе работы проводили исследования динамики изменения «пустых» ФХ-липосом и липосом с α-ЛК в плазме в течение четырех часов, используя метод ДРС. Для этого моделировали систему циркулирования липосом в плазме. Из анализа литературных источников было установлено, что липосомы циркулируют в крови в течение нескольких часов [9–11]. Исходя из этих данных, мы выбрали максимальное время инкубации 4 часа.

Эксперименты проводили in vitro на образцах крови, полученных у условно здоровых доноров. Образцы с полученными липосомами добавляли к плазме крови после чего проводили измерение размеров НЧ с помощью анализатора размеров частиц Delsa Nano C, (Beckman Coulter Inc., США) при их инкубировании в плазме (Т = 37 0С) в течение 4 часов. Полученные данные обрабатывали в программе DelsaNano v3.73. Результаты, полученных исследований, представлены на рисунке 2.

Рис. 2. Распределение наночастиц от интенсивности светорассеяния: в плазме (здор. доноры) (A), через 4 часа (B); в плазме (здор. доноры) с пустыми липосомами (C), через 4 часа (D); в плазме (здор. доноры) с α-ЛК-липосомами (E), через 4 часа (F)

В результате проведенного эксперимента было обнаружено, что плазма крови представляет с собой бисистему, содержащую фракцию компонентов плазмы с размером 60- 70 нм (100 %) (Рис. 2; А). При увеличении времени инкубации плазмы (Т= 37 0С) до 4-х часов (Рис 2; В) происходит изменение размеров наночастиц в сторону уменьшения их диаметров и увеличение количества фракций НЧ: 8 нм (15 %) и 60 нм (85 %). По-видимому, можно предположить, что происходило изменение размеров компонентов плазмы за счет образования новых типов липопротениов, различных белковых, белок-липидных комплексов и др. (размер которых находится в диапазоне 50–100 нм, Рис 2; В) в процессе инкубирования плазмы в течение 4-часов без липосом. Последующее добавление как и «пустых» ФХ-липосом, так и липосом с α-ЛК в плазму без инкубации привело к незначительному уменьшению размеров и содержания компонентов в плазме (46 нм, 30 %), и к появлению новой фракции, содержащей липосомальные наноконструкции с размерами 199 нм (70 %) — «пустые» ФХ-липосомы; и 165 нм (70 %) — α-ЛК-липосомы (Рис. 2; С, Е). В результате полученных данных было установлено, что при инкубации липосом в плазме в течение 4 часов их размеры практически не изменились (197 нм (70 %) — «пустые» ФХ-липосомы; и 150 нм (75 %) — α-ЛК-липосомы) (Рис. 2; D, F). Полученные данные исследования свидетельствует об отсутствии агрегации липосомальных наноконструкций между собой и взаимодействия с компонентами плазмы, приводящими к изменению их размеров.

В дальнейшем, после проведения дополнительных исследований, планируется применение липосомальной формы α-ЛК при комплексной терапии острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК). Поэтому на завершающем этапе работы проводили исследования динамики изменения «пустых» ФХ-липосом и липосом с α-ЛК в плазме у пациентов с острой ишемией головного мозга в течение 4-х часов.

Эксперименты проводили in vitro на образцах крови, полученных у пациентов, перенёсших острый ишемический инсульт. Образцы с полученными липосомами добавляли к плазме крови после чего проводили измерение размеров НЧ с помощью анализатора размеров частиц Delsa Nano C, (Beckman Coulter Inc., США) при их инкубировании в плазме (Т = 37 0С) в течение 4 часов. Полученные данные обрабатывали в программе DelsaNano v3.73. Результаты, полученных исследований, представлены на рисунке 3.

Рис.3. Распределение наночастиц от интенсивности светорассеяния: в плазме (пациенты с ОНМК) (A), через 4 часа (B); в плазме (пациенты с ОНМК) с пустыми ФХ- липосомами (C), через 4 часа (D); в плазме (пациенты с ОНМК) с α-ЛК-липосомами (E), через 4 часа (F).

В результате проведенных исследований было обнаружено, что плазма крови у пациентов, перенесших инсульт, состоит из небольших агрегатов различных белковых и белок липидных комплексов с размерами 25 нм (30 %) и 75 нм (70 %) (Рис. 3; А). При инкубировании данных образцов без липосом в течение 4-х часов происходило уменьшение размеров этих комплексов до 40 нм (Рис. 3; В). Добавление как «пустых» ФХ-липосом, так и липосом с α-ЛК в плазму без инкубации привело к появлению новой фракции, содержащей липосомальные наноконструкции с размерами 180 нм (85 %) — «пустые» ФХ-липосомы; и 218 нм (95 %) — α-ЛК-липосомы (Рис. 3; С, Е) и к значительному уменьшению содержанию компонентов плазмы крови, причем размеры их не изменились. По-видимому, незначительное увеличение размеров самих липосом (от 140 до 180 или 218 нм (См. Рис. 1 — А, D; Рис.3 С, Е) произойти в результате незначительных взаимодействий как и «пустых» ФХ- липосом, так и α-ЛК-липосом с компонентами плазмы (доноры с ОНМК) и образованию небольших агрегатов. При инкубировании и «пустых» ФХ- липосом в плазме (доноры с ОНМК) в течение 4-х часов происходило незначительное увеличение диаметра липосомальных конструкций от 180 нм до 217 нм (70 %), в результате взаимодействия плазменных компонентов с липосомами, и, при этом, происходило незначительное увеличение содержания фракции с непрореагировавшими с липосомами плазменными компонентами 30 нм (30 %) (Рис. 3; D). Инкубирование α-ЛК-липосом в плазме (ОНМК-пациенты) в течение длительного времени, наоборот, привело к уменьшению размеров НЧ (от 220 нм до 164 нм) и к незначительному образованию фракции, с пламенными компонентами (Рис. 3; F). Полученные результаты исследований свидетельствуют об отсутствии агрегации самих липосом, но незначительном изменении размеров «пустых» ФХ- липосом в результате взаимодействия с компонентами плазмы пациентов с ОНМК. Причем было отмечено, что липосомы с α-ЛК не образовывали агрегатов с плазменными компонентами. Полученные результаты можно объяснить тем, что липоевая кислота, по-видимому, стабилизирует липосомы за счет её взаимодействия с поверхностью мембраны (ФХ) и изменения её поверхностного заряда, в результате чего не происходит взаимодействия с компонентами плазмы и образования агрегатов.

Заключение.

Таким образом в ходе работы было показано, что липосомы, содержащие α-липоевую кислоту по сравнению с «пустых» фосфатидилхолиновыми липосомами стабильны при длительном хранении (в течение 18 месяцев при Т = +4 0С), не образуют агрегаты и не изменяют размеры. Изучение методом ДРС взаимодействия липосом, содержащих α-липоевую кислоту с компонентами плазмы крови здоровых доноров и пациентов с ОНМК показало, что не происходило существенного изменения размеров диаметров наночастиц при инкубировании α-ЛК-липосом в этих системах в течение 4-х часов.

Литература:

1. А. Ю. Барышников. Наноструктурированные липосомальные системы как средство доставки противоопухолевых препаратов. // ВЕСТНИК РАМН,2012, № 3, 24–31с.

2. J. Mahallagam, J. Nemunaitis et al. Phase-I study of intravenously administered ATI-1123, a liposomal docetaxel formulation in patients with advanced solid tumor. // Cancer Chemother Pharmacol., 2014, 74, 1241–1250 с.

3. В. А. Щелконогов, Сорокумова Г. М., О. А. Баранова А. В. Чеканов, К. Д. Казаринов и др. Липосомальная форма липоевой кислоты: получение и определение антиагрегационной и антиоксидантной активности.// Биомедицинская химия. 2016, 5, 577–583 с.

4. В. А. Щелконогов, Сорокумова Г. М., О. А. Баранова А. В. Чеканов, К. Д. Казаринов и др. Антиагрегационная эффективность липосомальной формы липоевой кислоты. (тезисы доклада, англ., русс.) Международная научно-практическая конференция «Биотехнологии в комплексном развитии регионов». 15–17 марта 2016, Москва.

5. Л. Л. Чайков. Метод динамического светорассеяния откроет новые возможности для медицинской диагностики.// Научные исследования, диагностика в медицине, 2014 г., http://science.spb.ru/allnews/item/1768-metod-dinamicheskogo-svetorasseyaniya (Дата обращения 28.09.17).

6. M. K. Campbell, & S. O. Farrell Biochemistry (5ed.). // Thomson Books Cole., 2006., 793 с.

  1. van der Vusse G. J. Albumin as fatty acid transporter. //Drug Metab Pharmacokinet 2009, 24(4) с.300–307.
  2. S. Guo, X. Shi, F. Yang, L. Chen, E. J. Meehan, C. Bian, M. Huang. Structural basis of transport of lysophospholipids by human serum albumin. //Biochem J, 2009, с.23–30.

9. O. S. Juliana, A. L. Elaine, D. C. Geovanni, M. C. Marzola, R. Domenico et.al. pH-Sensitive, Long-Circulating Liposomes as an Alternative Tool to Deliver Doxorubicin into Tumors: a Feasibility Animal Study. // World Molecular Imaging Society, Mol. Imaging Biol., 2016, (DOI: 10.1007/s11307–016–0964–7).

10. A. E. Tamer, V. P. Torchilin. Tumor-Targeted Nanomedicines: Enhanced Antitumor Efficacy In vivo of Doxorubicin-Loaded, Long-Circulating Liposomes Modified with Cancer-Specific Monoclonal Antibody.// Clin Cancer Res, 2009, (DOI:10.1158/1078–0432.CCR-08–2392).

11. Gert Storm, J. A. Daan. Crommelin. Liposomes: quo vadis?// research focus, PSTT Vol. 1, № 1, April 1998.

Основные термины (генерируются автоматически): плазма крови, течение, час, плазма, США, компонент плазмы, кислота, динамическое светорассеяние, физиологический раствор, динамик изменения.


Похожие статьи

Влияние липосомальной формы липоевой кислоты на...

Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали центрифугированием крови в течение 10 мин. при 135 g., при комнатной температуре.

На Рис. 4 представлена двумерная гистограмма отношения бокового и прямого светорассеяния плазмы крови обогащенной тромбоцитами...

Применение аутоплазмы в стоматологии при лечении...

В 1898 году в США врачи Grafstrom и Elfstrom впервые в мире произвели инъекции аутологичной крови в растворе поваренной соли при пневмонии и туберкулезе.

Это свойство отличает факторы роста тромбоцитарной аутологичной плазмы от рекомбинантных факторов роста...

Влияние разных типов питания на степень окислительной...

Для анализа использовали 0,1 мл плазмы крови кролика. К плазме приливали равный объём (1 мл) 0,1 М 2,4 – ДНФГ, растворённого в 2 М НСl. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течении 1 часа.

Оптимальный кристаллоидный раствор | Статья в журнале...

* — введение лактатов со скоростью до 100 ммоль/час не вызывает увеличение лактата плазмы крови при отсутствии тяжелых поражений печени, так как

Основные термины (генерируются автоматически): SID, Беларусь, раствор, внеклеточная жидкость, плазма крови, общая масса...

Оптические просветления кожи и крови: перспективы...

...компонентами тканей, несет информацию о структурных и динамических изменениях

Они были исследованы после содержание в растворах (кроме крови) глюкозы

С другой стороны, оптические просветления воздействуют двояким образом во время течения и остановки...

Плазмолифтинг как инновационный метод лечения хронических...

В 1898 г. в США при пневмонии и туберкулезе впервые в мире были проведены инъекции аутопламы в растворе поваренной соли.

Следующим этапом в развитии методов, использующим аутокровь, стало применение плазмы части крови, свободной от эритроцитов и...

Роль оптики при изучении параметров крови | Статья в журнале...

Поэтому анализ крови является главным компонентом любых диагностических исследований. В настоящее время широко распространены оптические методы изучения и характеризации клеток крови, такие как светорассеяние и флуоресценция [1]. Собственно проблема влияния света...

Похожие статьи

Влияние липосомальной формы липоевой кислоты на...

Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали центрифугированием крови в течение 10 мин. при 135 g., при комнатной температуре.

На Рис. 4 представлена двумерная гистограмма отношения бокового и прямого светорассеяния плазмы крови обогащенной тромбоцитами...

Применение аутоплазмы в стоматологии при лечении...

В 1898 году в США врачи Grafstrom и Elfstrom впервые в мире произвели инъекции аутологичной крови в растворе поваренной соли при пневмонии и туберкулезе.

Это свойство отличает факторы роста тромбоцитарной аутологичной плазмы от рекомбинантных факторов роста...

Влияние разных типов питания на степень окислительной...

Для анализа использовали 0,1 мл плазмы крови кролика. К плазме приливали равный объём (1 мл) 0,1 М 2,4 – ДНФГ, растворённого в 2 М НСl. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течении 1 часа.

Оптимальный кристаллоидный раствор | Статья в журнале...

* — введение лактатов со скоростью до 100 ммоль/час не вызывает увеличение лактата плазмы крови при отсутствии тяжелых поражений печени, так как

Основные термины (генерируются автоматически): SID, Беларусь, раствор, внеклеточная жидкость, плазма крови, общая масса...

Оптические просветления кожи и крови: перспективы...

...компонентами тканей, несет информацию о структурных и динамических изменениях

Они были исследованы после содержание в растворах (кроме крови) глюкозы

С другой стороны, оптические просветления воздействуют двояким образом во время течения и остановки...

Плазмолифтинг как инновационный метод лечения хронических...

В 1898 г. в США при пневмонии и туберкулезе впервые в мире были проведены инъекции аутопламы в растворе поваренной соли.

Следующим этапом в развитии методов, использующим аутокровь, стало применение плазмы части крови, свободной от эритроцитов и...

Роль оптики при изучении параметров крови | Статья в журнале...

Поэтому анализ крови является главным компонентом любых диагностических исследований. В настоящее время широко распространены оптические методы изучения и характеризации клеток крови, такие как светорассеяние и флуоресценция [1]. Собственно проблема влияния света...

Задать вопрос