Библиографическое описание:

Кизеев А. Н., Мерзляк М. Н., Соловченко А. Е. Применение спектроскопии отражения для недеструктивного анализа пигментов в растительных тканях // Молодой ученый. — 2010. — №6. — С. 90-97.

Введение

Пигментный аппарат растений является чувствительным индикатором их физиологического состояния [13-16]. Содержание хлорофиллов и каротиноидов является важным показателем физиологического состояния растений, отражающим интенсивность фотосинтеза, адаптивные перестройки, изменения в онтогенезе, старении и стрессовых (антропогенных) воздействиях. В большинстве физиолого-биохимических исследований содержание пигментов в растениях определяют в экстрактах с помощью спектрофотометрического анализа. Применение этого метода сопряжено с разрушением тканей, трудоемко, требует достаточно длительного времени, использования органических растворителей, и часто сопряжено с артефактами, связанными с лабильностью пигментов, неполнотой их экстракции, присутствием других светопоглощающих комплексов и др. В связи с этим, весьма привлекательным является возможность недеструктивного анализа пигментов по спектрам отражения интактных тканей. Спектры отражения листьев претерпевают изменения при стрессах, старении, недостаточности минерального питания, действии загрязнителей среды, адаптации к световому излучению. Существенным преимуществом неповреждающих оптических методов является то, что измерения могут быть осуществлены с малыми затратами времени, вследствие чего возможен анализ большого количества образцов, что достигается с трудом при использовании классических методов. При этом растения остаются пригодными для последующих исследований. Следует также отметить появление на рынке портативных рефлектометров, снабженных гибкими световодами и способных обеспечивать получение качественной спектральной информации в полевых условиях, как с небольшой поверхности растительной ткани, так и с отдельного растения. Спектроскопия отражения широко используется в дистанционном зондировании в целях получения глобальной информации о состоянии посевов и растительных сообществ в целом [2].

Группой ученых Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, под руководством д.б.н., проф. М.Н. Мерзляка при участии зарубежных коллег была разработана общая методология анализа пигментов растений с использованием метода спектроскопии отражения [7-9; 13-21]. Основной задачей данной работы является поиск подходов к использованию метода спектроскопии отражения для анализа пигментов в растительных тканях с применением портативного оптоволоконного рефлектометра.

 

Объекты и методы

Объектами исследований послужили листья растений березы (Betula verrucosa L.) и кизильника (Cotoneaster alaunica L.), обладающие широкой вариацией пигментного состава в ходе осеннего старения листьев, а также хвоя голубой ели (Picea pungens Koster). Образцы (общее число более 500) отбирались в осенний период (октябрь-ноябрь 2009 г.) с деревьев, растущих вблизи биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

В работе использовали портативный оптоволоконный рефлектометр модульной конструкции, включающий источник света LS-1 с галогенной лампой накаливания, спектрорадиометр USB2000, оптоволоконный зонд на основе разветвленного световода, и держатель образцов собственного изготовления, обеспечивающий падение измеряющего луча на образец под углом 45° либо 90°, а также программное обеспечение OOBase32. Для каждого из образцов записывали спектр отражения в видимой области (400-700 нм) против стандарта из BaSO4 с использованием рефлектометра вышеописанной конструкции, после чего аналитически определяли содержание пигментов, согласно [3]. Для экстракции пигментов листья и хвою гомогенизировали в фарфоровой ступке в ацетоне с добавлением 200 мг карбоната кальция (для предотвращения феофитинизации). Гомогенаты центрифугировали в стеклянных пробирках при 3000-4000 g в течение 10 минут. Полученные экстракты немедленно спектрофотометрировали (спектрофотометр Hitachi 150-20). Концентрацию пигментов определяли по формулам Лихтенталера [12].

 

Результаты и обсуждение

В результате проведенной работы были получены массивы данных, содержащие информацию о коэффициентах отражения в видимой области спектра и о пигментном составе листьев и хвои изученных видов растений. Спектры отражения листьев березы и кизильника, измеренные на портативном рефлектометре, существенно варьировали в зависимости от содержания в них пигментов (рис. 1-2).

Рис. 1. Спектры отражения листьев Betula verrucosa L.

 

Рис. 2. Спектры отражения листьев Cotoneaster alaunica L.

 

Максимальные значения отражения были характерны для ближней ИК-области, в которой отсутствует поглощение пигментов. Минимальные коэффициенты отражения наблюдали в полосах сильного поглощения хлорофиллов (в синей и красной областях спектра) и каротиноидов (в синей области). У красных листьев кизильника с высоким содержанием антоцианов дополнительно наблюдали снижение отражения. В ходе осеннего старения листьев этих растений отмечено повышение отражения в красной области вследствие деградации хлорофиллов; в то же время отражение в синей области спектра повышалось незначительно, по-видимому, из-за преимущественного сохранения каротиноидов [15].

Спектры отражения хвои голубой ели также варьировали в зависимости от содержания в них пигментов (рис. 3).

Рис. 3. Спектры отражения хвои Picea pungens Koster

 

Для хвои ели было характерно низкое отражение при высоком содержании хлорофиллов и каротиноидов, которое изменялось в значительной степени синхронно, за исключением отдельных образцов побуревшей хвои.

Необходимо отметить, что спектры отражения ассимиляционных органов исследованных видов растений, измеренные с помощью портативного рефлектометра, были в целом сходны по форме и положению максимумов со спектрами, измеренными традиционным образом (с применением интегрирующей сферы).

Корреляционный анализ полученных данных позволил выявить спектральные полосы, характеризующиеся высокой корреляцией с содержанием искомых пигментов в широком диапазоне их изменения (рис. 4-6).

 

Рис. 4. Корреляция коэффициентов отражения R(λ) (кривая «R») и обратных коэффициентов отражения 1/R(λ) (кривая «RR») с содержанием суммы хлорофиллов a и b для листьев Betula verrucosa L.

 

Рис. 5. Корреляция коэффициентов отражения R(λ) с содержанием антоцианов (Ант) и с содержанием суммы хлорофиллов a и b (Хл a+b) для листьев Cotoneaster alaunica L.

 

Рис. 6. Корреляция коэффициентов отражения с величиной индекса, связанного с содержанием хлорофиллов (R800/R700-1) и с отражением при 700 нм (R700) для хвои Picea pungens Koster

 

Области спектра с максимальной чувствительностью коэффициентов отражения к содержанию хлорофиллов были найдены в дальней красной и ближней ИК (700–720 нм), а также в зеленой (550–570 нм) областях. Поглощение антоцианов (плечо или полосы около 550-600 нм) обычно проявляется на фоне значительного поглощения хлорофиллов и каротиноидов. В красных листьях кизильника при минимальных значениях хлорофиллов, антоцианы накапливаются в большом количестве, и практически полностью определяют низкое отражение в зеленой части спектров (рис. 5). Корреляция коэффициентов отражения с величиной индекса, связанного с содержанием хлорофиллов (R800/R700-1) и с отражением при 700 нм для хвои голубой ели показана на рис. 6.

Соотношение между каротиноидами и хлорофиллами является важной характеристикой состояния фотосинтетического аппарата растений. Естественная (например, при осеннем старении) и искусственная (вызванная антропогенными загрязнителями) деградация хлорофиллов, может протекать на фоне сохранения каротиноидов, что приводит к росту соотношения каротиноидов и хлорофиллов [1,15,16,23,24]. В данной работе это явление наблюдали на примере листьев березы (рис. 7). Увеличение данного соотношения, по-видимому, является результатом усиления протекторной функции желтых пигментов, ингибирующих процессы перекисного окисления липидов в листовых тканях [1,5].

Рис. 7. Зависимость между содержанием каротиноидов и хлорофиллов в листьях

Betula verrucosa L.

 

В результате проведенной работы была подтверждена применимость ранее предложенных спектральных индексов [2] для недеструктивной оценки содержания пигментов в листьях изученных видов растений по измерениям спектров отражения, выполненных при помощи портативного спектрофотометрического оборудования. Изменения в содержании хлорофиллов и каротиноидов можно оценить, используя индекс PSRI (от Plant Senescence Reflectance Index), в котором используются коэффициенты отражения при 500, 678 и 800 нм: PSRI = (R678 – R500)/R800 [15,18]. При анализе листьев с различным содержанием пигментов было обнаружено, что отражение в максимуме поглощения хлорофиллов в красной области (около 678 нм) тесно коррелирует с отражением около 500 нм – в полосе совместного поглощения хлорофиллов и каротиноидов. В листьях березы с содержанием хлорофилла меньше 3 нмоль/см2 этот индекс сильно коррелирует с отношением каротиноидов к хлорофиллам (рис. 8).

Рис. 8. Зависимость между индексом PSRI (пропорциональному соотношению каротиноидов и хлорофиллов) и содержанием суммы хлорофиллов a и b при осеннем старении для листьев Betula verrucosa L. (r2 > 0.8)

 

Отдельной задачей является наблюдение за динамикой содержания антоцианов, также способных выполнять защитную функцию [10,11,22,25,26]. Высокий потенциал для недеструктивной оценки содержания антоцианов (на примере листьев кизильника) показал спектральный индекс ARI (от Anthocyanin Reflectance Index), вычисляемый по формуле: ARI = (1/R550 – 1/R700)*R800 [2], в котором отношение 1/R550 чувствительно к содержанию антоцианов, отношение 1/R700 чувствительно к содержанию хлорофиллов и позволяет внести поправку на вклад этих пигментов в поглощение при 550 нм, а коэффициент R800 позволяет учесть гетерогенность оптических свойств листьев, не связанную с поглощением пигментов [6]. В наших экспериментах индекс ARI проявлял высокую линейную корреляцию с содержанием антоцианов в листьях кизильника на фоне сильно варьирующего содержания хлорофиллов (рис. 9).

 

Рис. 9. Зависимость между индексом ARI и содержанием антоцианов в листьях Cotoneaster alaunica L.

 

Для определения содержания хлорофиллов, были предложены спектральные индексы в виде простых отношений коэффициентов отражения при длинах волн с низкой (R800) и высокой (R700) чувствительностью к содержанию хлорофиллов (ChlRI, от Chlorophyll Reflectance Index). Высоким потенциалом для недеструктивной оценки содержания хлорофиллов в листьях березы обладал спектральный индекс R800/R716–1 (рис. 10). Для недеструктивной оценки хлорофилла в неповрежденной хвое ели может быть использован спектральный индекс R800/R710–1 (рис. 11). Связь этих индексов с содержанием хлорофиллов была линейной.

Рис. 10. Зависимость между индексом ChlRI (R800/R716-1) и содержанием суммы хлорофиллов a и b в листьях Betula verrucosa L.

Рис. 11. Зависимость между индексом ChlRI (R800/R710-1) и содержанием суммы хлорофиллов a и b в хвое Picea pungens Koster

 

Спектры отражения ассимиляционных органов растений могут претерпевать изменения в результате побурения и некротизации тканей, что связано с образованием окрашенных продуктов, возникающих при окислении полифенольных соединений. Использование спектрального индекса BRI (от Browing Reflectance Index): BRI = (1/R510 – 1/R550)/R800, разработанного для количественной оценки побурения при повреждении тканей растений [2,4], позволило дифференцировать образцы хвои голубой ели с симптомами повреждения и без них (данные не приводятся). Наибольшие изменения (снижение отражения) происходят в зеленой области (510-550 нм) и при 800 нм. Это открывает широкие возможности для применения индекса BRI для недеструктивной количественной экспресс-оценки влияния на растения таких повреждающих факторов, как кислотные дожди, загрязнение тяжелыми металлами, и др. поллютантами, распространенными в Мурманской области вследствие деятельности металлургических предприятий, а также других абиотических стрессоров, вызывающих повреждение ассимиляционных органов растений с последующим их побурением.

 

Заключение

В результате проведенной работы получен массив данных для разработки спектральных индексов при оценке содержания пигментов в ассимиляционных органах изученных видов растений по спектрам отражения. Показана применимость портативного оптоволоконного рефлектометра для недеструктивного анализа пигментов. Необходимо подчеркнуть, что указанный метод особенно удобен для экспресс-анализа содержания пигментов в полевых условиях. Найдены подходы для разработки недеструктивных методов анализа пигментов в модельных видах и видах-индикаторах, используемых для оценки антропогенного стресса в экосистемах Мурманской области. Адаптированы спектральные индексы PSRI (для оценки соотношения каротиноидов и хлорофиллов), ARI (для оценки содержания антоцианов), ChlRI (для оценки содержания хлорофиллов) и BRI (степень развития побурения при повреждении) для использования с портативным оптоволоконным рефлектометром при полевых измерениях.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ «Мобильность молодых ученых» 2009 г. (№ 09-04-90753).

 

Литература

1.                  Кизеев А.Н. Влияние промышленных загрязнений на состояние ассимиляционного аппарата сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) на Кольском полуострове: автореф. дисс…канд. биол. наук (03.00.16, 03.00.05). – Петрозаводск, 2006. – 26 с.

2.                  Мерзляк М.Н., Гительсон А.А., Чивкунова О.Б., Соловченко А.Е., Погосян С.И. Использование спектроскопии отражения в анализе пигментов высших растений // Физиология растений.  - 2003. – 50. – C. 785-792.

3.                  Соловченко А.Е., Чивкунова О.Б., Мерзляк М.Н., Решетникова И.В. Спектрофотометрический анализ пигментов в плодах яблони // Физиология растений. -2001. – 48. – C. 801-808.

4.                  Chivkunova O., Solovchenko A., Sokolova S., Merzlyak M., Reshetnikova I., Gitelson A. Reflectance spectral features and detection of superficial scald-induced browning in storing apple fruit // Russ. J. Phytopathol.  - 2001. – 2. – P. 73–77.

5.                  Demmig-Adams B., Adams W. Photoprotection in an ecological context: the remarkable complexity of thermal energy dissipation // New Phytologist. - 2006. – 172. – P. 11-21.

6.                  Gitelson A.A., Merzlyak M.N., Chivkunova O.B. Optical properties and nondestructive estimation of anthocyanin content in plant leaves // Photochem. Photobiol. – 2001. – 74. – P. 38-45.

7.                  Gitelson A.A., Zur Y., Chivkunova O.B., Merzlyak M.N. Assessing carotenoid content in plant leaves with reflectance spectroscopy // Photochem. Photobiol. – 2002. – 75. – P. 272-281.

8.                  Gitelson A.A., Gritz Y., Merzlyak M.N. Relationships between leaf chlorophyll content and spectral reflectance and algorithms for non-destructive chlorophyll assessment in higher plant leaves // J. Plant Physiol. – 2003. – 160. – P. 271-282.

9.                  Gitelson A., Keydan G., Merzlyak M. Three-band model for noninvasive estimation of chlorophyll, carotenoids, and anthocyanin contents in higher plant leaves // Geophys. Res. Lett.  – 2006. – 33. – L 11402.

10.              Hoch W., Singsaas E., McCown B. Resorption protection. Anthocyanins facilitate nutrient recovery in autumn by shielding leaves from potentially damaging light levels // Plant Physiol. - 2003. – 133. – P. 1296-1305.

11.              Karageorgou P., Manetas Y. The importance of being red when young: anthocyanins and the protection of young leaves of Quercus coccifera from insect herbivory and excess light // Tree Physiol.  - 2006. – 26. – P. 613.

12.              Lichtenthaler H. Chlorophyll and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes // In Meth. Enzym. - 1987. – P. 331-382.

13.              Merzlyak M., Gitelson A. Why and what for the leaves are yellow in autumn? On the interpretation of optical spectra of senescing leaves (Acer platanoides L.) // J. of Plant Physiol. – 1995. – 145. – P. 315-320.

14.              Merzlyak M., Gitelson A., Pogosyan S., Lekhimena L., Chivkunova O. Light-induced pigment degradation in leaves and ripening fruits studied in situ with reflectance spectroscopy // Physiologia Plantarum. – 1998. – 104. – P. 661-667.

15.              Merzlyak M., Gitelson A., Chivkunova O., Rakitin V. Non-destructive optical detection of pigment changes during leaf senescence and fruit ripening // Plant Physiol. – 1999. – 106. – P. 135-141.

16.              Merzlyak M., Solovchenko A., Chivkunova O. Patterns of pigment changes in apple fruits during adaptation to high sunlight and sunscald development // Plant Physiol. et Biochem.. – 2002. – 40. – P. 679-684.

17.              Merzlyak M., Solovchenko A., Gitelson A. Reflectance spectral features and non-destructive estimation of chlorophyll, carotenoid and anthocyanin content in apple fruit // Postharvest Biol. and Technol. – 2003. – 27. - P. 197-212.

18.              Merzlyak M., Gitelson A., Chivkunova O., Solovchenko A., Pogosyan S. Application of reflectance spectroscopy for analysis of higher plant pigments // Russ. J. of Plant Physiol. - 2003. – 50. – P. 704-710.

19.              Merzlyak M.N., Solovchenko A.E., Smagin A.I., Gitelson A.A. Apple flavonols during fruit adaptation to solar radiation: spectral features and technique for non-destructive assessment // J. Plant. Physiol. – 2005. – 162. – P. 151-160.

20.              Merzlyak M.N. Modeling pigment contributions to spectral reflection of apple fruit // Photochem. Photobiol. Sci. – 2006. – 5. – P. 748-754.

21.              Merzlyak M.N., Chivkunova O.B., Solovchenko A.E., Naqvi K.R. Light absorption by anthocyanins in juvenile, stressed, and senescing leaves // J. Exp. Bot. – 2008. – 59. – P. 3903-3911.

22.              Merzlyak M.N., Melo T.B., Naqvi K.R. Effect of anthocyanins, carotenoids, and flavonols on chlorophyll fluorescence excitation spectra in apple fruit: signature analysis, assessment, modelling, and relevance to photoprotection // J. Exp. Bot. - 2008. – 59. – P. 349-359.

23.              Solovchenko A., Chivkunova O., Merzlyak M., Gudkovsky V. Relationships between chlorophyll and carotenoid pigments during on-and off-tree ripening of apple fruit as revealed non-destructively with reflectance spectroscopy // Postharvest Biol. and Technol. – 2005. – 38. – P. 9-17.

24.              Solovchenko A., Avertcheva O., Merzlyak M. Elevated sunlight promotes ripening-associated pigment changes in apple fruit // Postharvest Biol. and Technol. - 2006. – 40. – P. 183-189.

25.              Steyn W.J., Wand S.J.E., Jacobs G., Rosecrance R.C., Roberts S.C. Evidence for a photoprotective function of low-temperature-induced anthocyanin accumulation in apple and pear peel // Physiologia Plant. - 2009. – 136. – P. 461-472.

26.              Zeliou K., Manetas Y., Petropoulou Y. Transient winter leaf reddening in Cistus creticus characterizes weak (stress-sensitive) individuals, yet anthocyanins cannot alleviate the adverse effects on photosynthesis // J. Exp. Bot. - 2009. – 60. – P. 3031-3042.

Основные термины (генерируются автоматически): betula verrucosa l, коэффициентов отражения, Спектры отражения, Корреляция коэффициентов отражения, содержанием суммы хлорофиллов, анализа пигментов, Спектры отражения листьев, спектроскопии отражения, Plant Physiol, Gitelson A, picea pungens koster, недеструктивного анализа пигментов, Спектры отражения хвои, spectral features and, apple fruit, Solovchenko A, листьев betula verrucosa, plant leaves, содержания хлорофиллов, содержания пигментов.

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle
Задать вопрос