Автор:

Рубрика: Биология

Опубликовано в Молодой учёный №3 (137) январь 2017 г.

Дата публикации: 24.01.2017

Статья просмотрена: 3 раза

Библиографическое описание:

Матчанова Д. Ш. Митохондриальная плазмидоподобная ДНК хлопчатника pGHm2 // Молодой ученый. — 2017. — №3. — С. 228-230. — URL https://moluch.ru/archive/137/38579/ (дата обращения: 24.04.2018).



Генетическая инженерия существует немногим более 20 лет. Она показала свои возможности в области прокариотических организмов. Однако новые технологии, применяемые к высшим растениям пока не столь значительны. Попытки применения приемов генетической инженерии к высшим растениям тесно связаны с фундаментальными исследованиями. Важнейшими задачами, стоящими перед генетической инженерией и биотехнологией сегодня, являются: повышение продуктивности сельскохозяйственных растительных культур, создание новых культивируемых в сельском хозяйстве видов, защита окружающей среды и утилизация отходов, создание новых экологически чистых процессов преобразования энергии и получения минеральных ресурсов. Попытки оптимизации любого биотехнологического процесса, в основном, направлены на улучшение их генетических свойств. В настоящее время разрабатываются и применяются принципиально новые методы, основанные на технологии рекомбинантных ДНК. Модификация генетического материала осуществляется разными методами: в живом организме (in vivo) и вне его (in vitro), это два направления — клеточная инженерия и генетическая инженерия [1].

Генетическое разнообразие живых организмов находится в прямой зависимости от изменений, происходящих в последовательности четырех основных пар, которые образуют молекулу ДНК, и составляют генетический код. Генетическое разнообразие зависит от ядерного, митохондриального и хлоропластного содержания ДНК в клетке, количество хромосом и структуру ДНК.

Изучение структурной организации и выяснение функционирования внеядерных геномов высших растений является одной из наиболее важных задач современной молекулярной биологии. Это определяется биологической ролью хлоропластов и митохондрий в жизни клетки и организма в целом. Известно, что эти органоиды кроме основных своих функций — обеспечение клетки энергией, отвечают также за устойчивость организма к различным стрессовым факторам.

У некоторых организмов найдена цитоплазматическая ДНК, структурно ассоциированная с митохондриями, но отличающаяся от собственной ДНК этих органелл. В нём может находиться до 30 % всей ДНК клетки или даже больше, чем в самом ядре. Цитоплазматические ДНК, совсем не связанные с митохондриями, обнаружены у многих эукариот: животных, дрозофилы, высших растений. В цитоплазме клеток позвоночных найдены кольцевые, сверхспирализованные, либо линейные ДНК, напоминающие плазмиды бактерий. Предполагают, что они имеют ядерное происхождение, но несут локусы ori — точки инициации репликации и поэтому способны к внехромосомному размножению и наследованию. Роль этих плазмидоподобных структур в организмах эукариот не ясна, однако у кукурузы с ними связывают феномен цитоплазматически наследуемой мужской стерильности.

Современная теория и практика защиты растений от болезней должны основываться на глубоких молекулярно-генетических знаниях. Только на основе этих знаний возможно создание эффективных технологий предупреждения развития болезни у пораженных растений предупреждение развития болезни у зараженного растения будет технологией «хай-тек» 21 века [2].

Открываются новые возможности управления устойчивостью растений посредством практического использования комбинированных плазмид для трансформации их в геном растений. Большие успехи достигнуты в таких направлениях, как физико-химический и структурный анализ состава плазмидных ДНК, выявление и изучение пластидных мутаций, генетический и биохимический анализ природных различий, генетическое и физическое картирование и выявление кодирующих фрагментов. Плазмидоподобные ДНК привлекают внимание исследователей как потенциальные векторы для генетической инженерии растений.

Выделение митохондрий из корешков двухдневных этиолированных проростков выполнили по методу Т. Юсупова и др. [3]. Корешки измельчали в буфере для гомогенации (буфер А: 0,3 М сахароза, 50Мм трис-HCl, рН 7,8, 3мМ ЭДТА,0,1 % БСА, 0,1 ПВП 5000 мкг/мл гепарин) в течении 30 сек в высокоскоростном гомогенизаторе МР (Польша). Отфильтрованный гомогенат (3000 обр./мин 10 мин) для освобождения от клеточных обломок, затем митохондрии осаждаются центрифугированием в режиме 12000 обр./мин 45 мин. Органеллы суспендируют в исходном буфере А, наслаивают на ступенчатый градиент (0,6 М: 0,9 М: 1,6 М) центрифугируют при 22000 обр./мин 60 рН 7,8мин. Слой между 1,6 М и 0,9 М сахарозой отбирают, ресуспензируют в буфере 0,05Мм трис-HCl, рН 8,0, 0,02 М ЭДТА, 2 % саркозил натрия, 300 мкг/мл протеиназы К и выдерживали 1 час при 370 С. Лизат дважды депротеинизировали равным объемом насыщенного смесью: фенол — хлороформ (50+50), и один раз — смесью: хлороформ + изоамиловый спирт (24:1). Водную фазу отбирали и осаждали 2,5 объема охлажденного этанола и 3 М ацетат натрия, рН 5,8 до конечной концентрации 0,3 М. осадок должен растворяться в ТЕ буфере (10 мМ трис НСl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА). Добавив к раствору хлористый цезий и краситель центрифугируют в бакет-роторе С–45 ультрацентрифуги К-32 при режиме 37 000 обр./мин в течении 48 часов при 180 С, полученную таким методом ДНК экстрагировали и отмывали от красителя депротеинизацией с последующим осаждением.

Полученные ДНК обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами в соответствующих условиях. Препараты ДНК, продукты реакции с рестрикционными эндонуклеазами анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле разной концентрации в горизонтальных пластинках.

К началу работ по изучению митохондриального генома хлопчатника редко можно было встретить сообщения о плазмидоподобных ДНК (ппДНК). У высших растений существование таких структур ставилось под сомнение. Однако, при выделении препарата ДНК по выше рекомендованной методике вместе с митохондриальной ДНК (мтДНК) хлопчатника обнаружены были и быстро мигрирующие фракции. При сравнении электрофоретической подвижности этих ДНК с линейными фрагментами известной длины установили размер ппДНК, равный примерно 6,5 и 2,3 т. п. н. для pGHm1 и pGHm2, pGВm1 и pGВm2 (p — plasmide, G — Gossypium, H — hirsutum, B — barbadense, M — mitochondrial). В научной литературе опубликовано, что ппДНК обнаружены у кукурузы, сорго, сахарной свеклы, табака и пшеницы. Детально изучены ппДНК кукурузы (s -1 и s -2).

Структурные компоненты генома такого характера, в частности ппДНК, очень важны в свете их практического использования в новых технологиях для создания новых сортов растений. В связи с этим была поставлена цель: изучение первичной структуры ппДНК pGHm2.

Как выявлено в процессе исследований pGHm2 имела наименьший размер среди других ппДНК — 2,215 т. п. н., но по числу копий на митохондриальный геном (мт-геном) — около 4. Это количество ближе к максимальному числу копий на мт-геном. Для клонирования ппДНК pGHm2 обработали рестриктазой Sal 1 и получили линейный фрагмент. Изучаемая нами ппДНК была подвержена обработке еще девяти эндонуклеаз и выявлены сайты рестрикции, характерные для них.

В составе ппДНК pGHm2 входят уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз Асс I, Bss GII, EcoR I, Kpn I, Pvu I и XbaI (табл.1).

Таблица 1

Сайты рестрикции ппДНК pGHm2 митохондрий хлопчатника

пп

Ферменты рестрикции

Сайты рестрикции

Координаты сайтов

Количество сайтов

1.

Асс I

GT MKAC

61

1

2.

Bam H 1

G GATCC

1289, 1880

2

3.

Bss GII

G CGCGC

2143

1

4.

EcoR I

G AATTC

2068

1

5.

Hind III

A AGCLL

1203,1303

3

6.

Kpn I,

GGTAC C

2084

1

7.

Pst I

GTGCA

2016,2041

2

8.

Pvu I

CGAT CG

1833

1

9.

Sac I

GAGCT C

707,2078

2

10.

XbaI

1783

1

В первичном составе ппДНК pGHm2 выявлены многочисленные прямые, обращенные повторы и палиндромы. А, как известно, такие структуры могут играть определенную роль в процессе регуляции репликации. Компьютерным анализом первичной структуры pGHm2 выявлено 31 прямой повтор, протяженностью в более чем в 10 нуклеотидов, и шесть из них представлены двумя и тремя копиями. В составе ппДНК идентифицировано два инвертированных повтора, длиной в 10–12 пар нуклеотид. Имеются в ней и несколько палиндромов. Один из них расположен в пределах 1119–1131 и совпадает с открытой рамкой считывания (ОРС) и способен выполнять роль терминатора транскрипции. В pGHm2 выявлено пять ОРС. В ппДНК возникают шпилечные структуры, расположенные в пределах 1379–1392, 1588–1599 и 1841–1952.

Предположение о функции ппДНК, о перемещении их между геномами органелл уподобляет их мобильным генетическим элементам с присущими им функциями и структурами. Для проверки такой гипотезы были сопоставлены нуклеотидные последовательности pGHm2 со структурными элементами ядерного и пластидного геномов.

Литература:

  1. Волова Т. Г. Биотехнология. Учебное пособие. Новосибирск.1999. 254 с.
  2. Монастырский О. А., Хомченко Е. В. Цитогенетические механизмы вирулентности рас возбудителей ржавчины пшеницы и фузариоза колоса. (Интернет данные).
  3. Юсупов Т., Ибрагимов А. П., Рахматов Н. О., Ирисметов А. А. Получение чистых препаратов мтДНК из проростков хлопчатника и некоторые данные о ее структурной организации // Узб. биол. ж., 1984. № 6. С. 6–8.
Основные термины (генерируются автоматически): ппДНК pGHm2, высших растений, составе ппДНК pGHm2, высшим растениям, структуры ппДНК pGHm2, клонирования ппДНК pGHm2, генетической инженерии, геномов высших растений, Генетическое разнообразие, первичном составе ппДНК, генетической инженерии растений, первичной структуры, числу копий, высших растений существование, рестрикционными эндонуклеазами, пораженных растений предупреждение, ппДНК кукурузы, первичной структуры pGHm2, создание новых, нуклеотидные последовательности pGHm2.

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle
Задать вопрос