Электрохимические методы и приборы для определения антиоксидантов



В статье обсуждаются методы и инструменты для электрохимического определения антиоксидантной активности биосубстратов. Приведены доводы, подтверждающие эксплуатационные преимущества электрохимических (амперометрического и потенциометрического) способов определения антиоксидантой активности веществ с применением медиаторных реакций, содержащих электрохимически обратимую ред-окс пару.

Ключевые слова: электрохимические методы анализа, вольтамперометрия, кулонометрия, потенциометрия, амперометрия, антиоксидантная активность, определение

Введение

Повышенное внимание к антиоксидантам (АО), как важнейшего объекта исследования и анализа в науках о жизни, объясняется поисками методов профилактики старения организма и свободно-радикальных процессов, потенцирующих заболевания сердечнососудистой системы, неврологические, онкологические и другие патологии [1–3]. В связи с этим проблема контроля состояния антиоксидантной системы организма человека и ее коррекция с помощью как медикаментозных, так гомеопатических средств становится особенно острой [4]. При этом создание новых, экспрессных, универсальных и доступных методик оценки антиоксидантных свойств биосубстратов остается актуальной.

Механизм взаимодействия антиоксидантов со свободными радикалами и активными формами кислорода в водных средах протекает с передачей электронов и имеет донорно-акцепторную природу, а, следовательно, такие процессы целесообразно исследовать с использованием электрохимических методов, которые характеризуются высокой чувствительностью, быстротой, относительно невысокой стоимостью необходимого оборудования и реактивов, а значит, и анализа в целом [5,6].

Основные принципы электрохимических методов анализа изложены в многочисленных монографиях и учебно-методических пособиях, поэтому целью настоящей статьи является оценка аналитических возможностей электрохимических методов и приборов для определения антиоксидантной активности.

Обсуждение икомментарии

В настоящее время из способов определения антиоксидантной активности веществ с использованием электрохимических методов анализа можно выделить: кулонометрические (Г. К. Будников, И. Ф. Абдулин, Казанский государственный университет); потенциометрические (Х. З. Брайнина, Е. Л. Герасимова, Уральский государственный экономический университет, Екатеринбург); амперометрические (Я. И. Яшин, А. Я. Яшин, АО «Химавтоматика», Москва); вольтамперометрические (Е. И. Короткова, О. А. Аврамчик, Томский политехнический университет).

В таблице 1 приведены сопоставительные характеристики электрохимических методов определения АОА.

Таблица 1

Сопоставительная характеристика электрохимических методов определения АОА

Метод	Принцип метода	Достоинства	Недостатки
Циклическая вольтамперометрия	Определение Emax и последующий учет количества электричества	Прямое определение АО	Близкие значения Emax при необходимости учета количества электричества
Амперометрические биосенсоры, модифицированные ферментами или берлинской лазурью	Ферментативное получение супер-оксид-анион радикала О2●-, Н2О2 и их взаимодействие с АО с последующим измерением уменьшения тока	Использование активных форм кислорода (АФК) для определения АО	Малый ресурс работы биосенсора, трудоемкость процедуры изготовления биосенсора.
Катодная вольтамперометрия	Получение О2●- за счет электровосстановления растворенного в аналите кислорода. Измерение уменьшения тока после взаимодействия электрогенерированного О2●- с антиоксидантом	Прямое определение суммы антиоксидантов в аналите. Применение АФК для определения АО	Используются ртуть содержащие электроды. Необходимость учета сдвига потенциала первой волны электровосстановления О2 в зависимости от природы антиоксиданта. Использование кинетического параметра расчета АОА, зависящего от состояния поверхности индикаторного электрода. Относительно большие объемы аналита, необходимость перемешивания раствора. Невозможность использования в полевых и экспедиционных работах.
Кулонометрическое определение электро-генерированных титрантов (ЭТ) (хлора, брома, йода)	Получение ЭТ in situ. Измерение уменьшения количества электричества при взаимодействии с АО	Хорошая чувствительность метода. Корреляция с хемилю-минесцентным методом определения АО	Высокая химическая активность ЭТ. Различные ЭТ ведут себя с антиоксидантами по-разному.
Потенциометрическое определение АО с использованием медиаторов	Измеряется потенциал хорошо электрохимически обратимой ред-окс пары и его изменение в присутствии АО	Простота и надежность метода. Хорошие чувствительность, воспроизводимость и экспресссность	Относительно большие объемы аналита, необходимость перемешивания раствора. Необходимость нахождения стехиометрических коэффициентов реакции взаимодействия АО с окисленной формой медиатора.
Амперометрическое проточно-инжекционное определение индивидуальных АО с использованием жидкостного хроматографа «ЦветЯуза-01-АА» с амперометрическим датчиком	Подбирается потенциал окисления для каждого вещества антиоксиданта, присутствующего в пробе.	Высокие чувст-вительность и экспрессность метода. Использование микро-количеств анализируемого вещества. Высокая автоматизация метода.	Высокая стоимость прибора. Необходимость высокой квалификации оператора. Невозможность использования в полевых и экспедиционных работах.

Как видно, каждый из приведенных в таблице методов электрохимического определения антиоксидантов обладает как определенными достоинствами, так и недостатками. При этом суммарная антиоксидантная активность определяется по ингибированию сигнала в присутствии антиоксидантов в модельной или естественной медиаторной системе и выбор того или другого остается за самим исследователем, который в праве выбирать готовый, создавать новый или модифицировать уже известный метод, исходя из своих целей и возможностей.

Современный рынок аналитических приборов для электрохимического определения антиоксидантной активности представлен рядом моделей, функционирующих в рамках вольтамперометрического анализа.

Вольтамперометрия один из методов анализа, который в настоящее время наиболее динамично развивается [7]. Это обусловлено появлением новых материалов (в том числе и композиционных) пригодных для изготовления электродов, так и усовершенствованием электронных схем с использованием микропроцессорной техники. При сравнительной простоте оборудования этот метод сочетает в себе высокую абсолютную чувствительность (до десятых или сотых микрограмма элемента в литре раствора), многоэлементное определение в одной пробе, экспрессность и легкость автоматизации операций. По приводимым в зарубежных журналах обзорам он находится на третьем месте по частоте применения среди инструментальных методов анализа тяжелых металлов (атомно-абсорбционная спектроскопия и масс-спектрометрии).

По своей абсолютной чувствительности метод занимает очень неплохие позиции. Кроме высокой чувствительности не последнюю роль играет и стоимость анализа, включающая время работы оператора затраты на использование оборудования и расход реактивов и энергии. Немаловажную роль играет и стоимость оборудования.

В экологическом контроле вольтамперометрия прочно удерживает позиции экономичного и высокоэффективного метода анализа тяжелых металлов, давая при наименьших затратах наибольший объем информации по общему содержанию металлов.

Предназначенные ранее для анализа токсичных тяжелых металлов и некоторых органических (фенолы, серосодержащие вещества) поллютантов окружающей среды эти приборы могут быть применены в определении антиоксидантной активности.

На рисунке 1. представлена линейка приборов для осуществления вольт-амперометрического анализа [8].

Рис. 1. Приборы для вольтамперометрического анализа, выпускаемые российской промышленностью

Привлекательность любого инструментального метода связана не только с его потенциальными возможностями, но и с конкретным техническим исполнением, удобствами в работе с приборами и наличием определенного технического сервиса при их эксплуатации.

Нами была проведена модернизация вольтамперометрического оборудования на базе полярографа ПУ-1 Гомельского ЗИП, путем его подключения к компьютеру через мультмедийную звуковую карту [9]. Управляющей программой являлась программа, известная как «электронный самописец» PowerGraph 2.0. Такая модернизация прибора «вдохнула» вторую жизнь полярографу ПУ-1, поставив его в ряд с современными приборами (Рис.2).

а	б
Рис. 2. Компьютеризированный вольт-амперометрический комплекс на базе полярографа ПУ-1 (а); Поляризационные кривые первой волны электровосстановления кислорода на пленочном ртутно-графитовом электроде в 0,05 М фосфатном буфере, рН 6,86. (Отображено на мониторе ПК, работающего в режиме Power Ghaph 2.0) (б).

С его помощью нами были изучены электрохимические процессы катодного электровосстановления кислорода на электродах из различных материалов (Ag, Cu, Hg-C, графит и стеклографит) в присутствии антиоксидантов различного типа. Также была доказана антиоксидантная активность католита электроактивированной воды, полученной в диафрагменном электролизере «Эсперо-1» [10].

К недостаткам метода, пожалуй, можно отнести необходимость использования сравнительно больших объемов, до 20 мл, анализируемых растворов, перемешивание растворов, использование ртуть содержащих материалов и длительность измерений.

Нами был предложен электрохимический датчик, частично устраняющий эти проблемы [11]. С его помощью, необходимый объем анализируемого раствора был снижен до 10–100 мкл, что позволило исключить перемешивание. Однако и его применение в рутинном анализе антиоксидантов (и тяжелых металлов) также не позволило увеличить экспрессность определения. При этом заменять планарный электрод датчика, в виду его загрязнения предшествующими аналитами, приходилось через каждые 4–5 измерений.

Унифицирование методов электрохимического определения суммарной антиоксидантной активности на принципе вольтамперометрического определения кислорода до и после введения в буферный раствор вещества-антиоксиданта, привело к созданию компактного анализатора антиоксидантной активности АО-1 производства НПО «Полиант» (г.Томск) [12]. Внешний вид анализатора представлен на рисунке 3.

Рис. 3. Анализатор антиоксидантной активности АО-1: 1. Корпус. 2. Держатель электродов. 3. Разъемы для фиксации электродов. 4. Стаканчик с анализируемым раствором. 5. Магнитная мешалка. 6. Выключатель питания. 7. Держатель предохранителя. 8. Ввод сетевого кабеля. 9. Ввод кабеля связи с ПК.

Нами была предложена конструкция амперометрического датчика для определения суммарной АОА биопрепаратов [13,14]. В основе метода также лежит измерение тока деполяризации рабочего электрода, в процессе катодного электровосстановления (ЭВ) растворенного в буферной среде кислорода до и после введения в электрохимическую ячейку вещества-антиоксиданта. На рисунке 4 показаны принципиальная схема и внешний вид амперометрического датчика для определения суммарной АОА.

а	б	в
Рис.4.Схематичное (а) и фотоизображение (б) портативного амперометрического датчика для измерения суммарной антиоксидантной активности. Проведение измерений относительной АОА напитка «Тархун» с помощью портативного электрохимического датчика (в)

Датчик включает в себя рабочий электрод — катод из посеребряной проволоки диаметром 1 мм и вспомогательный электрод из медной проволоки или углеграфитового стержня, диаметром 1–2 мм. На катод накладывается опорное напряжение -500 мв от источника постоянного тока (батарейки). Этот потенциал, соответствует первой волне ЭВ кислорода в слабо протонированных растворах. Датчик подключен к измерительно-задающему устройству через микросхему — операционный усилитель, обеспечивающую индикацию максимального тока деполяризации каждые 5–7 секунд, а также возможность установления диапазона шкалы.

Перед началом работы датчик калибруют, погрузив его в буферный раствор (0,5 М фосфатный буфер, рН = 6,86). Показания на цифровом табло с помощью резистора на корпусе измерительно-задающего устройства устанавливают на «0».

Затем в буферный раствор вводится дозируемый объем раствора вещества — антиоксиданта, например аскорбиновой кислоты, определенной концентрации, и показания прибора с помощью второго резистора устанавливают на «100». С помощью откалиброванного прибора производят измерения АОА других биопрепаратов. Таким образом, антиоксидантная активность растворов веществ может быть измерена в процентах относительно аскорбиновой кислоты (или другого антиоксиданта). Небольшие габариты задающе-измерительного устройства позволяют разместить его на запястье правой руки оператора с помощью ремешка-«репейника» (Рис.4в).

К недостаткам разработанного нами устройства можно отнести малый ресурс работы датчика. Регенерировать рабочий электрод необходимо было через каждые 100–120 измерений.

Несмотря на простую технологию регенерации рабочего электрода, которая заключалась в очистке его поверхности азотной кислотой и осаждении на нее серебра, эта процедура вызывала определенные неудобства.

Приборы для кулонометрического определения антиоксидантной активности представлены кулонометром «Эксперт– 006» (НПО «Вольта», г. Ст-Петербург [15]. Кулонометр «Эксперт — 006» показан на рисунке 5.

Рис. 5. Кулонометр «Эксперт-006»

Эксплуатационные преимущества кулонометра «Эксперт– 006»

Технические:

‒ современная элементная база

‒ наличие микропроцессора

‒ возможность работы со сменными ячейками

‒ удобное подключение к ПК через интерфейс RS 232

‒ вывод результатов измерения на дисплей прибора или ПК

Аналитические:

‒ возможность работы и построения графиков без компьютера

‒ титрование до заданной точки или анализ всей кривой титрования

‒ возможность записи в память прибора результатов измерений количества вещества с указанием времени измерения.

К недостаткам прибора можно отнести также большие объемы растворов, необходимость их перемешивания, длительность измерения, связанного с электрогенерацией необходимого количества титранта.

Потенциометрические приборы, предназначенные для измерения оксидантной / антиоксидантной активности с использованием медиаторной реакции, содержащей ред-окс пару представлены многофункциональным потенциометрическим анализатором «МПА-1» [16]. Внешний вид прибора показан на рисунке 6.

Анализатор позволяет реализовать потенциометрический способ экспресс определения антиоксидантной активности — АОА [17,18].

Рис. 6.Многофункциональный потенциометрический анализатор «МПА-1»

Основные характеристики МПА-1:

Интерфейс МПА-1 состоит из жидкокристалического индикатора

(4 строки по 16 символов) и клавиатуры.

Программное обеспечение позволяет активировать функции прибора в любом сочетании.

Диапазон измерения потенциала:

от 4 до -4В.Предел обнаружения:

10^–6 М антиоксидантов;

время одного измерения — 3–5 мин.

В самом деле, прибор неплохо зарекомендовал себя в анализе антиоксидантной активности продуктов питания, напитков, вин. Кроме того, он олицетворяет лучшее соотношение «цена — качество» и доступен для приобретения небольшими лабораториями. К технико-эксплуатационным недостаткам можно отнести те же большие объемы анализируемых растворов и необходимость перемешивания.

Модификация этого метода привело к разработке нами анализатора антиоксидантной активности [19], который также основан на использовании в качестве медиатора ред-окс пары: K₃ [Fe(CN₆)]/K₄ [Fe(CN₆)]. Новым элементом в этом приборе является электрохимический датчик, позволяющий работать как в стационарном, так и проточно-инжекционном режимах. На рисунке 7 показан анализатор антиоксидантной активности ΣАОА.

Анализатор содержит электрохимический датчик с измерительным микроэлектродом из золота и Ag/AgCl электродом сравнения, расположенных в микроячейке, объемом 0,1 мл, которая подключена к цифровому милливольтметру. Время установления потенциала не превышает 15 сек. Инжекция анализируемой пробы, объемом 1,0 мл в рабочую микрокамеру датчика, осуществляет ее многократную промывку самим аналитом, что обеспечивает воспроизводимость сигнала.

Электрохимический датчик имеет USB — интерфейс и может быть подключен к персональному компьютеру и управляется посредством микропроцессора «Arduino».

Анализатор ΣАОА успешно апробирован в определении антиоксидантной активности экстрактов лекарственных растений [20], фитосборов и фиточаев [21,22], напитков и винопродукции [23].

Рис. 7. Анализатор антиоксидантной активности ΣАОА

В очередной раз, сравнивая потенциометрические и амперометрические методы анализа, следует отметить, что последние обладают неоспоримыми преимуществами. Одним из таких является прямая зависимость: аналитический сигнал (ток) — концентрация вещества, в то время как потенциометрические методы основаны на зависимости Нернста: аналитический сигнал (потенциал) — логарифм концентрации вещества, что предъявляет более строгие требования к метрологии измерения.

В этой связи несомненный интерес вызывают инженерные решения, предпринятые разработчиками прибора «ЦветЯуза-001-АА» (НПО «Химавтоматика», г.Москва) (Рис.8) [24].

Рис.8. Прибор «ЦветЯуза- 01-АА»

Рис. 9. Амперометрическая ячейка: а- схема ячейки с электродами типа «отражающая стенка»: 1 — рабочий электрод; 2 -вспомогательный электрод: б — внешний вид ячейки

Этот прибор сочетает в себе принципы жидкостной хроматографии и амперометрической детекции микроколичеств вещества антиоксиданта, окисляемого при определенном потенциале [25,26]. «Сердцем» этого прибора является амперометрический датчик «стенка-струя» с размещенным в нем микроэлектродом из инертного материала. Анализируемая проба вещества-антиоксиданта инжектируется с помощью крана-дозатора в хроматографическую колонку и с потоком жидкости элюента, продавливаемой плунжерным насосом под давлением до 35 атм, попадает в амперометрический датчик типа «стенка-струя». Амперометрический детектор измеряет электрический ток в ячейке (рис. 9) при окислении анализируемого вещества на поверхности рабочего электрода с наложенным потенциалом определённого значения.

Аналитический сигнал регистрируется на ленте самопишущего потенциометра или на мониторе компьютера в виде серии пиков. Высота пика или его площадь находятся в пропорциональной зависимости от концентрации вещества- антиоксиданта.

С помощью прибора «ЦветЯуза- 01-АА» в настоящее время определены водо- и жирорастворимые антиоксиданты, относящиеся к различным флавоноидам в продуктах питания, шоколаде, тонизирующих напитках, винах, растительных масел, лекарственных растениях и пр. [27]. Этот прибор наряду с прибором для потенциометрического определения антиоксидантов МПА-1, является, пожалуй, наиболее цитируемым в научной литературе, посвященной изучению свойств антиоксидантов. К недостаткам можно отнести его сравнительную дороговизну (более 12000 долларов США), что является пока недоступной для многих лабораторий.

Выводы

1. Критически обсуждены аналитические возможности электрохимических методов изучения свободнорадикальных процессов. Сопоставлены разработанные аналоги оборудования для определения антиоксидантов, с выпускаемыми промышленностью приборами.
2. Приведены доводы, подтверждающие эксплуатационные преимущества электрохимических (амперометрического и потенциометрического) способов определения антиоксидантой активности веществ с применением медиаторных реакций, содержащих электрохимически обратимую ред-окс пару.

Литература:

1. Владимиров Ю.А, Азизова О. А., Деев А. И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники, 2000. — Т. 29. — С. 151–167.
2. Барабой В. А., Брехман И. И., Голожин В. Г. Перекисное окисление и стресс. — М.: Наука, 2004. — 148 с.
3. Воскресенский С. К., Жутаев И. А., Бобырев В. Н. Антиоксидантная система, онтогенез и старение // Вопр. мед. Химии, 2004. — № 1. — C. 14–27.
4. Будников Г. К., Зиятдинова Г. Л. Антиоксиданты как объекты биоаналитической химии// Журн. аналит. химии. — 2005. — Т. 60, № 7. — С. 678–691.
5. Короткова Е. И. Новый способ определения активности антиоксидантов // Журн. физ. химии. — 2000. –Т.74, № 9. — С. 1704–1706.
6. Korotkova E. I., Karbainov Y. A., Shevchuk A. V. Study of antioxidant properties by voltammetry //J. Electroanalyt. Сhem. — 2002. — Vol. 518, № 1. — Р. 56–60.
7. Вяселев М. Р. Обобщенная теория вольтамперометрических методов и её приложение для повышения эффективности аналитических измерений // Автореф….доктора техн.наук. –Казань, 1984. — 44 с. / http://www.dissercat.com.
8. Вольтамперометрические (полярографические) анализаторы.// http:// techob.ru / katalog/katalog-priborov
9. Аронбаев С. Д., Насимов А. М., Аронбаев Д. М., Насыров Р. Х. Компьютеризированный аналитический комплекс для инверсионной вольтамперометрии на базе универсального полярографа ПУ-1 // Научный вестник Самаркандского Государственного Университета.- 2009.- № 1(53). — С.47–50.
10. Аронбаев Д. М. Исследование антиоксидантной активности фракций электрохимически модифицированной воды // МНО “Inter-Medical”(Ежемесячный медицинский журнал).- 2014.- № 3. — С.104–110.
11. Патент РУз на полезную модель FAP 00929 U 8 G 01 N 27/48. Электрохимический датчик / Аронбаев Д. М., Насимов А. М., Аронбаев С. Д. // Расмий ахборотнома. Фойдали моделлар. — 2014. — № 7.
12. «Анализатор АОА», ООО НПП «Полиант». Технические условия.
13. Аронбаев Д. М., Тен В. А., Аронбаев С. Д., Насимов А. М., Мусаева С. А. Портативный датчик для измерения антиоксидантной активности // Каталог VII Республиканской ярмарки инновационных идей, технологий и проектов. Промышленность. 1.1.25. Ташкент, 2014. — С.68–69.
14. Аронбаев Д. М., Тен В. А., Насимов А. М., Аронбаев С. Д., Кабулов Б. А. Амперометрический датчик для измерения суммарной антиоксидантной активности биопрепаратов // Тез. докл. II съезда Аналитика России — 2013. — Москва,2013. — С.157.
15. ТУ 4215–003–41541647–98 Аналитический кулонометр «Эксперт-006». Технические условия.
16. Анализатор многофункциональный потенциометрический «МПА-1". Каталог приборов ООО «Ива», научно-производственное внедренческое предприятие //http://ekb.neobroker.ru/Analizator-mnogofunkcionalnyi-potenciometricheskii-MPA-1_15764372.html
17. Брайнина Х. З., Иванова А. В., Шарафутдинова Е. Н. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов методом потенциометрии // Известия высших учебных заведений // Пищевая технология. — 2004. — № 4. — C. 73–75.
18. Патент РФ № 2486499 G01N 27/26 Способ определения оксидантной /антиоксидантной активности веществ и устройство для его осуществления. / Брайнина Х. З., Герасимова Е. Л., Ходос М. Я., Викулова Е. В., Чернов В. И., Носкова Г. Н.
19. Аронбаев Д. М., Тен В. А., Аронбаев С. Д., Насимов А. М., Юлаев М. Ф. Универсальный микропроцессорный анализатор для измерения антиоксидантной активности // Каталог VIII Республиканской ярмарки инновационных идей, технологй и проектов. — Ташкент, 2015. — С.185–186
20. Аронбаев Д. М., Тен В. А., Юлаев М. Ф., Аронбаев С. Д. Исследование антиоксидантной активности растительности Ферганской долины // Молодой ученый. — 2015, № 4(84).- С. 30–34.
21. Аронбаев Д. М. Апробация метода и прибора для определения антиоксидантной активности лекарственных растений и фитосборов на их основе // МНО «Inter-Medical», 2015 № 8 с.17–21.
22. Aronbaev D. M. Determination of the antioxidant activity of plants and herbal teas using theanalizer Sigma-AOA //World Science. -2016.-9(13).-Vol.2. –P.5–8.
23. Аронбаев Д. М., Аронбаев С. Д., Федоров Ф. Ф., Шертаева А. А. Определение антиоксидантной активности марочных, коллекционных и ординарных вин ОАО «Самаркандский винкомбинат им. М.Ховренко» // Universum: химия и биология. — 2017. — 2(32). /
24. Прибор для определения антиоксидантной активности ЦветЯуза-01-АА. Каталог приборов НПО «Химавтоматика». // http://medprom.ru/ medprom/594240
25. Яшин А. Я., Яшин Я. И. Аналитические возможности жидкостного хроматографа «ЦветЯуза» с электрохимическими детекторами // Рос.хим. журн. — 2002. — Т. 66, № 4. — С. 109–115.
26. Яшин Я. И., Яшин А. Я. Анализ пищевых продуктов и напитков методами высокоэффективной жидкостной и ионной хроматографии с электрохимическими детекторами // Журн. аналит. химии. — 2004. — Т. 59, № 12. — С. 1237–1243.
27. Яшин Я. И., Рыжнев В. Ю., Яшин А. Я., Черноусова Н. И. Природные антиоксиданты. Содержание в пищевых продуктах и их влияние на здоровье и старение человека. — М., 2009.