Библиографическое описание:

Кабицкая Я. А., Коновалова Т. А., Бойко Е. Г. Современные подходы к изучению популяции муксуна Обь-Иртышского рыбохозяйственного района // Молодой ученый. — 2016. — №6.5. — С. 73-78.



Настоящая статья посвящена исследованию внутривидовой изменчивости муксуна, обитающего в реке Обь (точка наблюдения Ямбура) во временном аспекте (2012 – 2014 гг.). На основании полученных данных проведен анализ внутривидовой изменчивости гена цитохром B (Сyt B) митохондриальной ДНК 89 экземпляров муксуна. Исследованные особи имеют одинаковый митохондриальный гаплотип и обладают низкой степенью полиморфизма по анализируемому локусу.

Ключевые слова: муксун Сoregonus muksun, генетическая структура популяций, ДНК-анализ, мтДНК, цитохром B, полиморфизм, секвенирование.

Введение. Муксун (Сoregonus muksun), обитающий в пределах Обь-Иртышского рыбохозяйственного района, представляет собой единую популяцию (стадо) и является ценным промысловым видом рыб. По систематическому положению муксун относится к типу Хордовые (Chordata), отряду Лососеобразные (Salmoniformes), семейству Сиговые (Coregonidae), роду Сиги (Coregonus) (Pallas, 1814). В таксономическом отношении он представляет собой наиболее сложную для изучения группу [1]. Долгое время в Обь-Иртышском рыбохозяйственном районе муксун [2] являлся приоритетным объектом промысла, вследствие чего его запасы резко снизились [3]. В Обском бассейне этот вид относится к ценным промысловым видам рыб, с резко сокращающейся численностью из-за нерационального промысла, нефтяного загрязнения и других факторов (рис. 1). В настоящий момент управление рыбными запасами осуществляется без учета внутривидовой структуры. Это может повлечь нарушение целостности вида в целом и негативно отразиться на его численности [4]. По инициативе ФГБНУ «Госрыбцентр» вылов муксуна в Обь-Иртышском рыбохозяйственном районе запрещен с 15.08.2014 г.

Рис. 1. Динамика вылова муксуна в водных объектах Тюменской области [4]

В связи с этим особенно актуальным является сохранение биоразнообразия и восстановление численности муксуна в бассейне. Без знаний генетической структуры это сделать невозможно. Данные об уровне внутривидовых генетических различий являются определяющими для устойчивого управления рыболовством с учетом сохранения эволюционно сложившегося биоразнообразия рыб. Поэтому такие исследования особенно актуальны для ценных, находящихся на грани исчезновения видов рыб.

Научная новизна данных исследований заключается в последующем использовании генетических маркеров для идентификации популяций и отдельных особей муксуна. Особая значимость этого исследования связана с искусственным воспроизводством муксуна и формированием генетических паспортов маточных стад.

Целью настоящей работы являлось изучение генетических особенностей муксуна из реки Обь (точка наблюдения (т.н.) Ямбура) в разные периоды времени (2012-2014 гг.).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

  1. Произвести сбор и пополнить коллекцию биологических тканей (плавник) муксуна Обь – Иртышского рыбохозяйственного района.
  2. Выделить ДНК и провести генетический анализ гена Cyt B митохондриальной ДНК (мтДНК) муксуна из реки Обь (т.н. Ямбура) в разные периоды времени (2012-2014 гг.).

Материалы и методы. Материалом для исследования послужил муксун из реки Обь в районе точки наблюдения Ямбура в количестве 89 экземпляров (рис. 2).

Рис. 2. Карта района сбора материала: 1 - река Обь (т.н. Ямбура)

Сбор тканей плавников муксуна осуществлен с 2012 по 2014 гг. сотрудниками эколого-сырьевых исследований ФГБНУ «Госрыбцентр». Пополнена коллекция тканей муксуна: 17 экземплярами в 2012 г., 9 - в 2013 г., 63 - в 2014 г.

Генетические исследования выполнены в молекулярно-генетической лаборатории Агробиотехнологического центра ГАУ Северного Зауралья и в лаборатории молекулярной генетики гидробионтов ВНИРО (г. Москва).

Выделение тотальной ДНК проводилось фенольным [5] и солевым методами с лизированием протеиназой К с использованием плашек PALL. Анализ количественной оценки тотальной ДНК проводился с помощью спектрофотометра.

Полноразмерная последовательность гена Сyt B (около 1100 п.н.) митохондриальной ДНК была амплифицирована на амплификаторе "Bio-Rad" T 100 ThermalCycler с использованием праймеров: GluDG и H16460. Реакция ПЦР - анализа проводилась в конечном объеме 25 мкл с 1 х ПЦР буфером (16,6 мМ (NH4)2SO4, 67,7 мМ Трис-HCl, рН=8,8, 0,1% (v/v) Tween 20), 1мкл 50 мМMgCl2, 5 мкл смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 150 пмоль праймера и 1 единиц Tag-полимеразы. В 0,5 мл пробирки вносились по 24 мкл реакционной смеси и 1 мкл исследуемой тотальной ДНК. Амплификация проводилась по схеме, представленной в таблице 1.

Таблица 1

Программа амплификации

Этап

Температура, °С

Время, минут

Предварительное денатурация ДНК

95

5

Синтез ПЦР-продуктов (40 циклов):

плавление

95

0,5

отжиг праймеров

60

0,5

синтез ДНК

72

1

окончательная достройка цепей

72

5

Длина ПЦР продукта варьировала до 1100 пар оснований. Визуализация ПЦР продукта проводилась в 2% агарозном геле в 0,5x кратном ТБЕ буфере и разгонялась в течение 30 минут при напряжении 120 V, окрашивание проводилось бромистым этидиумом. Детекция результатов проводилась на гель - сканере "Typhoon 8600" ("MolecularDynamics").

Секвенирование проводилось с праймера GluDG на автоматическом секвенаторе АВI 3100 Genetic Analezer (Applied Biosystems, США) с использованием набора для секвенирования BigDye v. 1.1. Кроме полученных данных, использована одна депонированная из базы данных GenBank, NCBI последовательность. Выравнивание и сборка контигов проводились путем анализа хроматограмм в программе "SeqMan", множественное выравнивание и последующее построение дендрограмм в программе "MegAlign" (Lasergene, США).

Результаты и их обсуждение. В последние годы генетические исследования стали применять более активно. Совершенствование технологии в области секвенирования открыли новые возможности в области популяционной генетики сиговых рыб, в частности, муксуна. Анализ видового состава с использованием мтДНК имеет ряд преимуществ по сравнению с анализом ядерных генетических маркеров: наличие большой копийности, устойчивости кольцевой структуры мтДНК к деградации и лучшая сохранность.

Исследования по локальным группировкам муксуна в данном направлении представлены единичным работами. По данным Балдиной С.Н. и др. [6] гаплотипы муксуна из разных бассейнов Сибири образуют общую группу с гаплотипами ледовитоморского пыжьяна.

Исследованы последовательности гена Cyt B 89 особей муксуна из реки Обь (т.н. Ямбура) в периоды сбора биоматериала с 2012 по 2014 гг. Проанализированы 89 последовательностей нуклеотидов гена Сyt B длиной 800 п.н.. На основании секвенирования гена Cyt B мтДНК построена дендрограмма генетического сходства изученных особей муксуна (рис. 3).

Рис. 3. Дендрограмма (NJ) генетического сходства последовательностей гена CytB у изученных особей муксуна

Дендрограмма демонстрирует генетическое расстояние между исследованными особями муксуна. Очевидно, что все особи группируются в единый кластер. Отдельную ветвь образует лишь одна особь. Учитывая незначительную генетическую разобщенность особей муксуна, а также одинаковые экологические условия обитания, можно предположить, о единстве популяции муксуна. Анализ полиморфизма SNP локусов выявил сходство и незначительные различия проанализированных особей муксуна из реки Обь. Полиморфные участки, предполагающие генетические различия, были отобраны, секвенированы и проанализированы программой "BLAST" на аналогию с последовательностями, имеющимися в GeneBank. Очевидно, что исследованные 75 гаплотипов характерны для C.muksun.

У 14 гаплотипов выявлен незначительный полиморфизм, представленный точечными мутациями (SNP) (табл. 2). Следует отметить, что однонуклеотидный полиморфизм (SNP) широко используют в качестве молекулярно-генетических меток (маркеров) для построения молекулярно-генетической систематики на основе дивергенции (расхождения) гомологичных участков ДНК в филогенезе.

Таблица 2

Анализ генетической гетерогенности популяции муксуна

Индивидуальный

номер рыбы

Место и год взятия выборки

Локализация замены нуклеотидного участка

Нуклеотидная

замена

121-12-4-022

р. Обь, т.н. Ямбура, 2012

351

C→Т

146-12-4-047

315

G→Т

157-14-5-015

р. Обь, п. Ямбура, 2014

351

C→Т

158-14-5-016

351

C→Т

160-14-5-018

315

G→Т

161-14-5-019

335

A→G

166-14-5-024

335

A→G

167-14-5-025

315

G→T

175-14-5-033

315

G→T

181-14-5-039

267

A→G

384

T→C

189-14-5-047

351

C→T

191-14-5-049

371

A→G

197-14-5-055

316

G→A

207-14-5-065

373

G→A

Полученные результаты генетических особенностей исследованных особей муксуна, выловленных из реки Обь (т.н. Ямбура) с 2012 по 2014 гг. не дает нам достаточных оснований для выделения муксуна данного района в отдельные комплексы. Можно предположить, что низкий уровень генетической изменчивости указывает на принадлежность исследованных особей муксуна к одной популяции. Очевидно, что для окончательного разъяснения данных задач потребуется провести дополнительное исследование по другим генетическим маркерам. Представленные результаты требуют дальнейших исследований: увеличение набора дифференцирующих признаков, привлечения большего числа особей и увеличение точек сбора материала.

Выводы. На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

1) Впервые исследована нуклеотидная последовательность гена цитохром B митохондриальной ДНК у 89 особей муксуна из реки Обь (точка наблюдения Ямбура), выловленных с 2012 по 2014 гг.

2) Выявлен низкий уровень нуклеотидного разнообразия гена цитохром B митохондриальной ДНК в исследованных выборках муксуна из реки Обь (т.н. Ямбура). Все исследованные особи муксуна объединены в один мономорфный кластер, что свидетельствует о значительной генетической однородности вида в пределах изученного ареала.

Литература:

  1. Решетников Ю.С. Экология и систематика сиговых рыб. – М.: Наука, 1980. 301 с.
  2. Кабицкая Я.А. Муксун (Coregonus muksun) Обь - Иртышского бассейна// Молодой ученый, 2015, №6.5, С. 170-172
  3. Балдина С.Н., Гордон Н.Ю., Политов Д.В. Генетическая дифференциация муксуна Coregonusmuksun (Pallas) и родственных видов сиговых рыб (Coregonidae, Salmoniformes) Сибири по мтДНК// Генетика, 2008, Т. 44, № 7, С. 896-905.
Основные термины (генерируются автоматически): особей муксуна, реки Обь, популяции муксуна, изученных особей муксуна, муксуна Обь, популяции муксуна Обь-Иртышского, внутривидовой изменчивости муксуна, отдельных особей муксуна, экземпляров муксуна, генетических особенностей муксуна, популяции муксуна реки, численности муксуна, вылова муксуна, вылов муксуна, искусственным воспроизводством муксуна, тканей муксуна, тканей плавников муксуна, единстве популяции муксуна, локальным группировкам муксуна, гаплотипы муксуна.

Ключевые слова

полиморфизм, секвенирование, муксун Сoregonus muksun, генетическая структура популяций, ДНК-анализ, мтДНК, цитохром B

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle
Задать вопрос