Способность управлять физическими, химическими и биологическими свойствами наноструктур дает исследователям возможность рационально разрабатывать и использовать наночастицы для эффективного направленного транспорта биомолекул к определенным клеткам и тканям [1]. Активное нацеливание липосомальных препаратов может достигаться присоединением к поверхности липосом «молекулярного адреса» — маркера, для связывания с которым клетка-мишень имеет соответствующие рецепторы [2].
Одним из таких маркеров может служить остаток фолиевой кислоты, поскольку фолатные рецепторы в больших количествах присутствуют на поверхности опухолевых клеток, в то время как их распределение на нормальных органах и тканях значительно меншье [3].
Целью данной работы является конструирование и изучение свойств липосомальной системы адресной доставки биомолекул в опухолевые клетки.
В данной работе были использованы производные фолиевой кислоты, ПЭГ и диэфира L-глутаминовой кислоты (соединения 1, 2 и 3) (схема 1) для поверхностной модификации липосом на основе липопептидов [4].
Рис. 1.
Поверхностную функционализацию липосом проводили двумя способами: в процессе их приготовления (рис. 1а), используя соединение 3, а также модификацией соединением 1 уже сформированных частиц (рис. 1б), содержащих соединение 2.
Рис. 1. Функционализация липосом: а) в процессе их приготовления, б) после получения бислойных агрегатов
В качестве основы для липосом использовали алифатические производные ди- и трипептидов строения OrnGlu(C16H33)2 или OrnOrnGlu(C16H33)2 соответственно. Для придания им адресной функции встраивали 5 % (по массе) соединения 3 или 1,5 % (по массе) соединения 2.
Изучены физико-химические свойства полученных частиц. Температуру фазового перехода (ТФП) бислойных агрегатов оценивали по графику зависимости отношения интенсивностей оптического поглощения эозина, встроенного в липосомы, от температуры. Было показано, что введение модифицирующего агента, также как и изменение строения полярной части амфифила в составе липосом не приводит к изменению ТФП бислойных агрегатов и для исследуемых композиций составляет 38–400С.
Размер частиц оценивали методом фотонно-корелляционной спектроскопии, основанном на принципах динамического светорассеяния, на анализаторе размеров частиц серии LSTM 13320 Beckman Coulter, USA. Установлено, что увеличение размера полярной части в случае мономеров приводит к уменьшению размера немодифицированных липосом от 150±10нм для алифатических производных дипептидов и до 100±10нм для липотрипептидов. Введение производного фолиевой кислоты, напротив, приводит к увеличению размера частиц в случае липосом на основе липотрипептидов до 130±10нм, и снижению размера модифицированных липосом на основе алифатических производных дипептидов до 40±10нм (рис. 2).
Рис. 2. Размер липосом на основе а) OrnGlu(C16H33)2, б) OrnOrnGlu(C16H33)2 после модификации вектором направленной доставки.
Стабильность липосомальных дисперсий при хранении оценивали по изменению оптической плотности во времени (рис. 3). Установлено, что введение производного фолиевой кислоты в состав липосом, также как и изменение строения липидов в составе частиц, не приводят к снижению седиментационной и агрегационной устойчивости, которая сохраняется более 100ч.
Рис. 3. Стабильность липосом при хранении
Цитотоксичность липосом определяли посредством МТТ теста в культуре клеток СНО. Метод основан на способности митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ живых метаболически активных клеток восстанавливать бесцветный водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил- 2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан, который кристаллизуется внутри клеток. Кристаллы формазана переводят в раствор с помощью органических растворителей, таких как диметилсульфоксид (ДМСО), с последующей спектрофотометрией. Восстановление клетками нитросинего тетразолия показывает метаболическую активность дегидрогеназ и является адекватным показателем жизнеспособности клеток в культуре, что позволяет оценить специфическую гибель клеток, вызванную агентом. Для немодифицированных липосом индекс цитотоксичности IC50 составил 27,5мкг/100мкл (рис. 4а), введение производного фолиевой кислоты не приводит к статистически достоверному изменению цитотоксичности (рис. 4б).
Рис. 4. Результаты МТТ теста для а) немодифицированных и б) модифицированных липосом на основе липопептидов
Таким образом, в результате работы предложен универсальный подход к созданию адресных липосом, который позволяет модифицировать в том числе уже сконструированные частицы, при этом цитотоксичность агрегатов не изменяется.
Литература:
- Omid C.Farokhzad, Robert Langer,Impact of Nanotechnology on Drug Delivery // ACSNANO, 2009, 16–20
- Ryo Suzuki,, Daiki Omata, Yusuke Oda, Johan Unga, Yoichi Negishi, Kazuo Maruyama. Cancer therapy with nanotechnology-based drug delivery systems: applications and challenges of liposome technologies for advanced cancer therapy // Nanomaterials in Pharmacology, 2016, 457–482
- Muller C, Schibli R. Folic acid conjugates for nuclear imaging of folate receptor-positive cancer // Journal of Nuclear Medicine, 2011, 52(1), 1–4
- Колоскова О. О., Буданова У. А., Себякин Ю. Л. Дизайн многофункциональных фолат-нацеленных систем доставки лекарственных препаратов // Биофармацевтический журнал № 4, Т.3, С.14–20, 2011
