Библиографическое описание:

Байриков И. М., Амосов А. П., Щербовских А. Е., Латухин Е. И., Сафаров С. А., Смолина А. В., Монаков Д. В. Повышение биологической совместимости традиционного никелид-титанового сплава и оценка его токсичности на культурах мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека в эксперименте [Текст] // Новые задачи современной медицины: материалы междунар. науч. конф. (г. Пермь, январь 2012 г.). — Пермь: Меркурий, 2012. — С. 41-42.

Особое место в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии занимают пористые изделия, позволившие решить многие проблемы при замещении дефектов костной ткани. Для пористых материалов медицинского назначения первостепенное значение имеют биохимическая совместимость с тканями организма. Биосовместимость определяется, в первую очередь, фазовым составом материала. Никелид титана, полученный методом самораспространяюшегося высокотемпературного синтеза (СВС), характеризуется фазовой неоднородностью – наряду с основной фазой TiNi в значительном количестве присутствуют вторичные фазы Ti2Ni и TiNi3 [Ходоренко В.Н., 2001]. Вопрос о влиянии вторичных фаз на биохимические свойства никелида титана остается открытым. Установлено, что наличие фазы Ti2Ni повышает электрохимическую коррозию имплантатов из литого никелида титана и, соответственно, может отрицательно влиять на их биосовместимость [Ильин А.А., 2007]. Однако экспериментальные и клинические исследования, выполненные В.Э. Гюнтером, не выявили негативного влияния вторичных фаз на биосовместимость СВС-никелида титана. Вместе с тем следует отметить, что фазовый состав оказывает сильное влияние на характеристическую температуру мартенситных превращений и параметры памяти формы. Изменение содержания компонентов на сотые доли процента ведут к сдвигу температуры фазовых превращений в материалах на основе никелида титана на десятки градусов [Ходоренко В.Н., 2001]. Поэтому в системе Ti-Ni желательно иметь только основную фазу TiNi и стабильные физико-механические свойства и параметры памяти формы. Содержание вторичных фаз в СВС-никелиде титана можно уменьшить за счет увеличения температуры синтеза в зоне фазообразования. С этой целью использовался предварительный нагрев исходной шихты внешним нагревателем [Ясенчук Ю.Ф., 2002]. Установлено, что при начальной температуре шихты 500 °С обогащенных никелем вторичных фаз (фаза TiNi3) практически не наблюдается. Увеличение начальной температуры шихты до 600 °С и выше приводит к повышению температуры в зоне фазообразования настолько, что из-за чрезмерного содержания жидкой фазы конечный продукт в поле сил тяжести теряет свою структурную устойчивость и происходит усадка и уменьшение пористости. Таким образом, предварительный нагрев исходной шихты внешним нагревателем не обеспечивает получение однофазного СВС-никелида титана из смеси порошков титана и никеля.

В этой связи для увеличения температуры синтеза предлагается использовать не внешний, а внутренний источник тепла в виде добавки в исходную шихту высокоэкзотермических реагентов. При этом продукты реакции добавляемых компонентов должны иметь биосовместимость с тканями организма и более высокую температуру плавления, чем соединения титана с никелем. Тогда силами поверхностного натяжения жидкой фазы частицы тугоплавкой фазы будут стягиваться в твердожидкий каркас, сохраняющий свою форму в поле сил тяжести. Указанным требованиям в полной мере отвечает нестехиометрический карбид титана TiC0,5. Температура горения при синтезе карбида TiC0,5 составляет 2500 °С, а температура горения при синтезе никелида титана с нагревом исходной шихты Ti-Ni до температуры 500 °С не превышает 1650 °С. Температура плавления карбида TiC0,5, которая равна Тпл ≈ 2500 °С, также намного выше, чем температура плавления наиболее тугоплавкой фазы TiNi3, у которой Тпл = 1380 °С.

Цель настоящей работы – повысить биологическую совместимость традиционного никелид титанового сплава и изучить его токсичность на культурах мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток костного мозга человека.

Материалы и методы

При составлении экзотермических шихт использовались порошки следующих марок: титан ПТС; углерод технический (сажа) П804Т и никель ПНЭ-1. Шихтовая смесь готовилась из расчета образования двухфазного продукта состава TiC0,5 – 25% (мас.) TiNi. Дозировка компонентов шихты осуществлялась с точностью 0,1 г. Приготовление экзотермической шихты массой 0,2 кг заданного состава производилось в шаровой мельнице объемом 1 л при соотношении масс шаров и шихты 3:1. Время смешивания составляло 4 часа. С целью повышения порообразования в шихту добавляли 2% (мас.) пищевого крахмала. Синтез проводили при комнатной температуре в газопроницаемой оболочке из речного песка. Микроструктурный анализ осуществляли на растровом электронном микроскопе Jeol JSM-6390A. Состав продуктов синтеза определяли методом рентгенофазового анализ. Съемка рентгеновских спектров проводили на дифрактометре ARL X′TRA. Для тестирования на токсичность, СВС-материал отмывали путем пятикратного погружения в 50 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (Sigma), высушивали, стерилизовали в автоклаве при температуре 121&#;С, 2,1 атм., в течении 20 минут. В работе были использованы мультипотентные мезинхимальные стромальные клетки 2 пассажа со следующим фенотипом: позитивны на CD73, CD90, CD105, CD44 и негативны CD14, CD34, HLA-DR. Клетки культивировали в стандартных условиях в инкубаторе SANYO MCO-20AV в режиме 37 °С, 5% СО в культуральных флаконах (NUNC), площадью 175 см2. Тестирование проводилось в культуральных 24 луночных планшетах (NUNC) на среде A-MEM (Sigma), с 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone), 2mM L- аланин-глутамина (Invitrogen). Опыт осуществляли методами прямого контакта и эксплантатов – мезинхимальных клеток. Исследуемый материал помещали в лунки 24 луночного планшета (NUNC) с культуральной средой, куда, через 10 минут помещали клетки (100.000 клеток на лунку) из культурального флакона. Морфология оценивалась при помощи инвертированного микроскопа проходящего света с системой видеонаблюдения «Сarl ZEISS Observer. A1» и электронного микроскопа JEOL JSM-63909A. Контролем эксперимента служили: 1) секции с питательной средой и образцами материала в которые не высеивали мезинхимальные клетки, 2) секции с культурами мезинхимальных клеток, которые пассировали и наблюдали одновременно с экспериментальными, не помещая материал.

Результаты эксперимента

Матрица материала имеет гладкую оплавленную поверхность, размер пор составляет 100 ÷ 400 мкм, пористость - около 50 % . Результаты рентгенофазового анализа показали, что продукты синтеза состоят только из двух фаз: нестехиометрического карбида титана TiC0,62 и стехиометрического никелида титана TiNi. Таким образом, увеличение температуры синтеза за счет тепла реакции образования карбида титана TiC0,62 позволило предотвратить образование вторичных фаз. В условиях культивирования мультипотентных мезинхимальных стромальных клеток человека с образцами во всех случаях наблюдалось визуальное увеличение количества клеток, что не отличалось от роста в контрольной группе. Данные световой микроскопии показывали, что с 1 по 4-е сутки клетки распластывались на поверхности образцов. При ежедневном наблюдении был отмечен нормальный рост культур в рабочей группе, характерный для фибробластоподобных клеток, по характеру роста и размеру не отличающихся от таковых в контрольной группе. На 5-8-е сутки во всех ислледуемых образцах клетки достигли 80% монослоя на поверхности пластика. В исследуемых и контрольных группах были обнаружены первые единичные клетки в порах материала, которые находились в их просвете, фиксируясь к стенкам. С 9-е по 18-е сутки наблюдалась положительная динамика увеличения количества клеток в просвете пор. Во всех группах мезинхимальные клетки сохраняли характерную морфологию, при световой микроскопии во всех порах, доступных визуальному осмотру, наблюдали большие скопления клеток. С 18 по 30-е. сутки визуальная картина вокруг материала и на его поверхности, при световой микроскопии, не изменялась. На 9 день 2 образца материла – 1 контрольный и 1 рабочий были изъяты из культуральной посуды, двукратно отмыты в PBS, затем помещены в новую культуральную посуду с питательной средой без клеток для проведения тестирования методом «экспланта». На 12 сутки в рабочей группе были обнаружены первые клетки, прикрепившиеся к поверхности пластика непосредственно возле материала. В контрольной группе клеток обнаружено не было. На 15-17 сутки в рабочей группе наблюдались значительное количество мигрировавших клеток с поверхности материала. К 21 суткам клетки образовали крупные колонии. В группе контрольного материала на протяжении всего исследования клеток обнаружено не было.

Выводы

В ходе проведённого эксперимента, мы не смогли обнаружить признаки какого либо негативного воздействия нового СВС-материала TiC0,5TiNi на клетки. Морфология клеток, скорость пролиферации, плотность межклеточных контактов оставалась аналогичной клеткам в контрольной группе. Такие наблюдения позволяют нам сделать вывод об абсолютной индифферентности СВС-материала TiC0,5TiNi со сквозной пористостью, отсутствие его токсичности к культурам мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток, хорошие адгезивные свойства клеток к поверхности материала и пролиферативную активность. Произведённые исследования позволяют рекомендовать данный материал к внедрению в клиническую практику в качестве материала для изготовления имплантатов.

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle