Библиографическое описание:

Кумакшева Е. В., Потт А. Б., Компанец Г. Г. Сравнение вирулентности штаммов хантавирусов Амур и Сеул для новорожденных белых мышей // Молодой ученый. — 2015. — №19. — С. 249-252.

Хантавирусы (род Hantavirus, семейство Bunyaviridae) широко распространены во многих регионах мира. В основном, вирусы этого рода переносятся грызунами и передаются человеку при вдыхания аэрозолей инфицированных выделений хронически инфицированных особей. К настоящему времени в мире выделено и охарактеризовано более 40 типов хантавирусов, роль некоторых из них в патологии человека до конца не установлена [1]. В России среди мелких грызунов циркулируют 10 видов хантавирусов и только 5 из них являются возбудителями геморрагической лихорадки с почечным синдром (ГЛПС) у людей: Пуумала, Хантаан, Сеул, Амур, Добрава/Белград. В Приморском крае установлена роль в патологии человека следующих хантавирусов: генетический вариант Far East вируса Хантаан (природный носитель — полевая мышь Apodemusagrarius), вирус Амур с природным хозяином восточноазиатская мышь (Apodemuspeninsulae) и генетический вариант Владивосток вируса Сеул, который циркулирует в популяциях серой крысы (Rattus norvegicus) [2].

Несмотря на длительную историю изучения хантавирусов и успехи современной вирусологии, многие вопросы этиологии, лабораторной диагностики, патогенеза (особенно ранних фаз), терапии и профилактики хантавирусной инфекции у людей изучены недостаточно. Так до настоящего времени нет универсальной модели-животного, которое было бы пригодно как для исследования биологических свойств хантавирусов, так и для имитации клинического заболевания у человека. Для исследования биологических свойств хантавирусов (вирулентности, иммуногенности и т. д.) используют разные виды лабораторных и диких животных, в зависимости от их чувствительности к разным серотипам вируса [3].

Цель настоящей работы — изучить вирулентность для новорожденных лабораторных животных штаммов двух серотипов хантавирусов, патогенных для человека и циркулирующих в очагах Приморского края.

Материалы и методы

Штаммы хантавируса. Для заражения лабораторных животных использовали следующие штаммы хантавируса: ВАМ 15–99 (вирус Амур), Seo 80–39 и SR-11 (вирус Сеул) из рабочей коллекции лаборатории хантавирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г. П. Сомова. В эксперименте использовали вируссодержащий супернатант, полученный при инфицировании линии клеток Vero E-6 вышеуказанными штаммами хантавируса. Титр вируса определяли согласно методике Lee P. W. et al. [4], в нашем эксперименте он составлял не менее 3,0 lg ФОЕ/1,0 мл.

Животные. В эксперименте использовали сосунков белых лабораторных мышей в возрасте 24–48 часов (n= 30, 6 самок). Животных (1 самка и новорожденное потомство в отдельной клетке) содержали в стандартных условиях вивария: в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой, стандартный рацион и питьевой режим предоставлен в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР от 10 марта 1966 г. № 163 и приказом Минздрава СССР от 10.10.83 № 1179 (пункт 4.1). Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. Уход за инфицированными животными и работу с ними осуществляли в условиях вивария с уровнем безопасности Р-3 (BSL-3).

Условия эксперимента. Вирулентность одного штамма хантавируса изучали, заражая по отдельности потомство двух самок. Путь заражения интрацеребральный, введение однократно, доза составила: 1,1 ФОЕ/0,01 мл, 1,2 ФОЕ/0,01 мл и 1,3 ФОЕ/0,01 мл для штаммов ВАМ 15–99, Seo 80–39 и SR-11, соответственно. Начиная с 13–14 дня после заражения (p.i.) дважды в день наблюдали за общим состоянием животных, отмечая признаки инфекции, и при выраженных клинических симптомах, свидетельствующих о терминальной фазе инфекции, проводили вскрытие мышей под общим наркозом эфиром. Для исследования на наличие специфических антител отбирали образцы крови, для обнаружения антигена хантавируса отбирали образцы различных органов (мозг, легкие, печень, почки, селезенка, сердце). При отсутствии симптомов заболевания животных обескровливали под общим наркозом на 35–40 день после заражения и также отбирали образцы для исследований. Группы мышей, зараженных разными хантавирусами, содержали в отдельных помещениях, для исключения возможности перекрестной аэрогенной контаминации.

Непрямой метод флюоресцирующих антител (НМФА). Для выявления титра специфических антител в сыворотках крови экспериментально инфицированных животных использовали НМФА, постановка которого осуществлялась согласно методическим рекомендациям [5]. В качестве вторичных антител использовали антивидовые ФИТЦ-меченые антитела против глобулинов мыши производства «Медгамал» ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Антиген хантавируса определяли в 10 % суспензиях органов животных с помощью тест-системы «Хантагност» Предприятия по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова в соответствии с рекомендациями производителя.

Реакция нейтрализации (РН) проводилась для обнаружения антихантавирусных нейтрализующих антител. Реакция основана на методе определения подавления антителами фокусобразующих единиц (ФОЕ) хантавируса в культуре клеток под полужидким покрытием (0,6 % карбоксиметилцеллюлозы) [6].

Результаты

Все три исследованных штамма хантавируса обладали вирулентностью для сосунков белых мышей, вызывая у 100 % животных клиническую инфекцию с типичными симптомами (вялость, истощение, парезы и параличи конечностей). Однако, несмотря на аналогичные условия заражения (одинаковая доза вируса, путь введения и возраст животных) отмечены различия в сроках появления симптомов заболевания, впоследствии приводящих к гибели животных. Так в группе, зараженной штаммом SR-11, выраженные симптомы ухудшения состояния животных наблюдали уже с 14 дня p. i., тогда как у животных, инфицированных штаммами ВАМ 15–99 и Seo 80–39 с 17 и 19 дня p. i., соответственно. Гибель животных отмечали в течение 2, 4 и 5 дней с момента значительного ухудшения состояния животных (= гибели первого животного в группе), более быстрая и массовая гибель сосунков наблюдалась при заражении штаммом SR-11.

Наличие специфических антител в сыворотках крови и антигена в органах животных, зараженных разными штаммами, свидетельствовало о хантавирусной инфекции, как причине гибели животных во всех группах. Однако титр специфических антител существенно отличался. Средний титр по результатам НМФА составил: 1:8, 1:30,4 и 1:66,0 при инфицировании штаммами ВАМ 15–99, SR-11 и Seo 80–39, соответственно.

Кроме того, анализ распределения антигена хантавируса по различным органам экспериментальных животных показал наличие системной инфекции, вызываемой тремя штаммами, однако при заражении штаммом ВАМ 15–99 антиген обнаружен во всех исследованных органах, кроме мозга и печени, а при заражении штаммами SR-11 и Seo 80–39 — только в легких и в печени.

Обсуждение

В настоящее время считается, что в ходе длительной ко-эволюции каждый тип хантавируса прочно адаптировался к одному типу хозяина — грызуну, насекомоядному и т. п. [1]. Поэтому для эффективного размножения хантавирусов и моделирования клинической хантавирусной инфекции предпочтительно использование наиболее близкородственных животных, в идеале — природных носителей. Однако трудности содержания колонизированных природных хозяев ограничивают диапазон пригодных модельных животных. Строгая гостальность и выраженные межвидовые отличия хозяев отражаются в разной чувствительности к хантавирусам, например, штамм Sotkamo вируса Пуумала, изолированный от рыжей полевки (Myodesglareolus) более эффективно размножался на модели новорожденных монгольских песчанок, в сравнении с лабораторными мышами и крысами того же возраста [7].

Полученные нами результаты свидетельствуют, что вирулентность штаммов даже одного серотипа хантавируса может существенно отличаться при использовании разных моделей. Хотя в нашем опыте два исследованных штамма вируса Сеул были вирулентными для сосунков белых мышей, штамм SR-11, выделенный в Японии от белой крысы во время лабораторной вспышки ГЛПС, обладал наибольшей вирулентностью, в сравнении со штаммом Seo 80–39, изолированным от дикой крысы, более быстро вызывая заболевание и гибель экспериментальных животных. В то же время оба штамма серотипа Сеул (SR- 11 и Seo 80–39) обладали достаточной иммунногенностью, вызывая образование специфических антител, в титре, определимом у каждого инфицированного сосунка в двух методах (НМФА и РН), в отличие от штамма ВАМ 15–99, при заражении которым отмечен крайне низкий титр антител 1:8 (НМФА) у 80 % зараженных животных. Кроме того выявлены отличия в тропности двух типов хантавирусов (Амур и Сеул) к тканям экспериментально инфицированных животных, вероятно, связанные с разной степенью инвазивности исследованных штаммов и разницей в чувствительности выбранной модели к данным штаммам. Наличие антигена вируса Амур во всех исследованных органах на фоне низкой иммунногенности свидетельствует о развитии системной хантавирусной инфекции, имитирующей природное заражение.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженных различиях в вирулентности штаммов серотипов хантавирусов Амур и Сеул для сосунков белых мышей в экспериментальных условиях и могут стать основой для разработки эффективной модели выделения и изучения хантавирусов invivo.

 

Литература:

 

1.                  Manigold T., Vial P. Human hantavirus infections: epidemiology, clinical features, pathogenesis and immunology // Swiss Med. Wkly. — 2014. — 144, w. 13937 doi:10.4414/smw.2014.13937

2.                  Yashina L. N., Patrushev N. A., Ivanov L. I., Slonova R. A., Mishin V. P., Kompanets G. G., Zdanovskaya N. I., Kuzina I. I., Safronov P. F., Chizhikov V. E., Schmaljohn C., Netesov S. V. Genetic and serological diversity of hantaviruses associated with HFRS in the Far East of Russia // Arch. Virol.- 2000. — № 70 (1–2). — С. 31–44.

3.                  Yoo Y.C., Yoshimatsu K., Yoshida R., Tamura M., Azuma I., Arikawa J. Comparison of virulence between Seoul virus strain SR-11 and Hantaan virus strain 76–118 of hantaviruses in newborn mice // Microbiol. Immunol. — 1993. — Vol. 37, No. 7. — P. 557–562.

4.                  Lee P., Gibbs C., Gajdusek D., et al. // J. of Clin. Microbiol. — 1985. — Vol.22, N 6. — P. 940–944.

5.                  Методы лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом. — М., 1982.

6.                  Дзагурова Т. К., Ткаченко Е. А., Башкирцев В. Н., Окулова Н. М., Апекина Н. С. и др. Выделение и идентификация штаммов хантавирусов-возбудителей ГЛПС в европейской части России // Медицинская вирусология. — 2008. — Т. XXV. — С. 142–50.

7.                  Lokugamage N., Kariwa H., Lokugamage K., Hagiya T., Miyamoto H., Iwasa M.A., Araki K., Yoshimatsu K., Arikawa J., Mizutani T., Takashima I. Development of an efficient method for recovery of Puumala and Puumala-related viruses by inoculation of Mongolian gerbils // J. Vet. Med. Sci. — 2003. — № 65 (11). — 1189–94.

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle