Методом электрофореза с иммобилизованным субстратом исследован молекулярный состав и различия в активности различных форм пищеварительных амилаз личинок Leptinotarsa decemlineata. Проведен денситометрический анализ результатов разделения, позволяющий количественно оценить активность ферментов. Показано достоверное отличие в соотношениях активности различных форм фермента на разных стадиях развития насекомых, что может свидетельствовать о роли амилолитических ферментов в адаптации вредителей.
Ключевые слова: колорадский жук, амилазы, зимография, адаптация.
By electrophoresis with immobilized substrate, we investigated the molecular composition and the differences in the activity of various forms of digestive amylases of larvae of Leptinotarsa decemlineata. Densitometric analysis of the results of separation, allowing quantifying the activity of enzymes, was performed. A significant difference in the ratio of the activity of the various enzyme forms at different stages of insect developmentwas shown, and it may indicate a role of amylolytic enzymes in the adaptation of pests.
Keywords:Leptinotarsa decemlineata, amylase, zymographic technique, adaptation.
У колорадского жука обнаружен комплекс гидролитических ферментов (протеиназы, амилазы, липазы и др.), позволяющих ему эффективно перерабатывать растительную пищу [4]. Одними из наиболее активных карбогидраз колорадского жука считаются амилазы [3], являющиеся одним из важных факторов усвоения растительной пищи насекомым [2]. В отличие от протеолитических ферментов, амилазы колорадского жука исследованы сравнительно слабо. Известно, что состав амилолитических ферментов в пищеварительном тракте некоторых насекомых может претерпевать определенные изменения в зависимости от стадии развития [1]. В этой связи актуальным представляется изучение молекулярного состава амилаз насекомых-вредителей, закономерности его изменения, а также выявление факторов, вызывающих данные изменения. Целью нашей работы являлось исследование возрастной динамики активности различных форм амилаз колорадского жука.
Зимография является электрофоретическим методом, который включает в себя полимеризацию субстрата в полиакриламидном геле для обнаружения ферментативной активности [5]. Активность ферментов визуализируется после их электрофоретического разделения в денатурирующих условиях и последующей ренатурации. Методы зимографии используются для изучения гидролаз различных типов.
Для изучения возрастной динамики активности различных форм амилаз исследовали личинок II, III, IV стадий развития. Навеску личинок разных возрастов гомогенизировали в равном количестве дистиллированной воды и выдерживали в смеси с буфером для образцов в течение 20 минут при 70 °С. Полученные образцы наносили на гель и анализировали методом зимографии.
Рис 1. Оценка активности различных форм амилаз личинок на разных стадиях развития методом зимографии. Окраска раствором Люголя. Римскими цифрами обозначены стадии развития насекомых. Исходное изображение геля переведено в черно-белый режим и инвертировано.
Для количественной оценки выявленных различий в активности амилаз проводили денситометрический анализ полученной зимограммы с последующей статистической обработкой (рис. 2).
Рис 2. Компьютерный анализ активности различных форм амилаз личинок на разных стадиях развития. Римскими цифрами обозначены стадии развития насекомых. А — высокомолекулярная форма, б — форма со средним значением молекулярной массы, в — низкомолекулярная форма. По вертикальной оси — единицы ферментативной активности, калибровка по амилазе B. subtilis. В качестве величины погрешности показан доверительный интервал выборочного среднего.
Анализ возрастной динамики активности амилаз показывает во многом сходную картину соотношения активностей различных форм ферментов на разных стадиях развития. Вместе с тем, достоверно выявляются отличия в активности высокомолекулярной формы амилазы по сравнению с остальными формами между второй и четвертой стадиями развития личинок. Одной из возможных причин появления таких различий является изменение состава пищеварительных амилаз в процессе адаптации насекомых к ингибиторам кормовых растений, являющимся важным компонентом их защитных механизмов.
Литература:
1. Яшина И. М. Генетические и методические аспекты традиционной селекции картофеля на устойчивость к колорадскому жуку // Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.- С.102–107.
2. Рябченко Н. А., Никитин Н. И. Влияние пищевого фактора на микро-эволюцию колорадского жука // Вестник Днепропетровского университета. — 2006. — Т. 1. С. 165–171.
3. Дунаевский Я. Е. Эндогенные ингибиторы протеаз как фактор устойчивости растений / Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.- М. Наука, 2000.- С.119–123.
4. Велобова Е. Н. Переваривание белков. Киев: гродынец,1993, 29 с.
5. Hempelmann, E., Putfarken, B., Rangachari, K., Wilson, R. J. M. Immunoprecipitation of malarial acid endopeptidase. Parasitology, 1986. № 92. P. 305–312.
