Библиографическое описание:

Тарасов С. С. Влияние разных типов питания на степень окислительной модификации белков плазмы крови кролика (Oryctolagus cuniculus) // Молодой ученый. — 2011. — №12. Т.1. — С. 116-120.

Активные формы кислорода (АФК), к которым относятся О2-, НОО, Н2О2, ОН-, образуются в результате реакций многоступенчатого восстановления молекулярного кислорода. АФК участвуют в метаболических процессах организма, связанных с обменом липидов, белков, нуклеиновых кислот, в синтезе лейкотриенов, тромбоксанов, являются продуктами метаболических процессов, ферментативных и не ферментативных, которые в норме протекают в организме [1,6,7]. Генерация АФК происходит по ходу окислительно-востановительных реакций с участием кислорода в различных субклеточных структурах клетки и при различных её функциональных состояниях [3,13].

Окислительная модификация белков (ОМБ) играет важную роль в обороте протеинов в организме. Накопление окисленных белков рассматривается как один из факторов регуляции синтеза и распада протеинов, активации мультипротеалитических протеаз, избирательно разрушающих окислительные белки. Фактически разрушение окислительных белков рассматривается как проявление вторичной антиоксидантной защиты в организме [11]

ОМБ происходит постоянно во всех живых организмах. На интенсивность деструктивных процессов и процессов распада окисленных метаболитов влияет 2 фактора: внешний, т.е. влияние окружающей среды и внутренний – процессы образования активных форм кислорода (АФК) и их утилизация в результате деятельности антиоксидантной системы (АС). Оба этих фактора взаимосвязаны. Одним из внешних факторов, оказывающих влияние на деструктивные процессы биополимеров, в том числе и на уровень окислительной модификации белков, является питание. Это и послужило основанием для изучения влияние разных типов питания на окислительную модификацию белков плазмы крови кролика. В связи с чем были поставлены следующие задачи:

  1. Установить, как те или иные компоненты рациона животных влияют на окислительную модификацию белка плазмы крови кролика.

  2. Выявить наиболее оптимальный вариант кормления сельскохозяйственных животных в отношении рост биомассы и безопасность продукции.

  3. Выяснить, какие продукты питания усиливают ОМБ, а какие снижает эти процессы.

Исследования проводили на кроликах породы «Советская шиншилла» в возрасте от 3 до 5 месяцев [9]. Животных выращивали на кролиководческой ферме «RabbitStar» ООО «Вита Аструм» в стандартных условиях. Сформированные группы выделяли из общего стада кроликов и в течение 2-х недель устанавливали им определённый тип питания. Всего в эксперименте было сформировано 3 группы по 7 животных в каждой. Для 1-й группы был установлен так называемый «естественный» тип питания, для 2-й «традиционный» и для 3-й «инновационный». Естественный тип питания включал те продукты, которыми кролик питается в естественных условиях (трава, ветки деревьев и кустарников, не очищенные колосья зерновых, в не больших количествах плодоовощные культуры). Традиционный – это тот тип кормления, который применяли и сейчас применяют большинство кролиководов любителей и многие фермеры, включает в свой состав сено, большое количество зерновых культур, а так же плодоовощные культуры, минеральные добавки. [10].Он характеризуется обеднённым составом сырой растительности. Наконец, инновационный тип кормления – применяется на современных фермах и хозяйствах, включает в себя всего лишь 2 компонента это грубый корм (сено) и комбикорма – содержащие все необходимые питательные вещества, витамины и микроэлементы.[2]. Все исследуемые животные в течение 2-х недель постоянно имели в наличии пищу, соответствующей кормовой группы. На 1, 3, 7 и 14 сутки этого периода у них проводили забор крови из ушной вены и исследовали её. В крови определяли продукты, образовавшиеся в результате окислительной модификации белков (МОБ).

Определение карбонильных производных в плазме крови кролика проводили по модифицированной методике Дубининой [5]. Её принцип основывается на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4 – денитрофенилгидразином (2,4 – ДНФГ) с образованием производных 2,4 – динитрофенилгидразона [12,14]. Для анализа использовали 0,1 мл плазмы крови кролика. К плазме приливали равный объём (1 мл) 0,1 М 2,4 – ДНФГ, растворённого в 2 М НСl. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течении 1 часа. Затем в пробы добавляли 20% трихлоруксусную кислоту (ТХУ) для осаждения белков. Затем пробы центрифугировали при 3000 g в течении 15-20 минут. Осадок промывали 3 раза раствором этанол – этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4 – ДНФГ, который не реагировал с карбонильными группами окисленных белков. Полученный осадок подсушивали с целью устранения оставшегося растворителя этанол – этилацетат и затем растворяли в 8 М растворе мочевины. Мочевину приливали к осадку в объёме 3 мл и выдерживали в кипящей бане в течение 5-10 минут до полного растворения. Оптическую плотность образовавшихсяденитрофинилгидразонов регистрировали на спектрофотометре СФ – 2000.

В результате окисления белков могут образоваться альдегидные и кетонные группировки аминокислотных остатков, которые взаимодействуют с 2,4 – ДНФГ. Из данных литературы известно, что для алифатических альдегид-денитрофенилгидразонов нейтрального характера спектр поглощения зарегистрирован в диапазоне 260 – 558 нм, основного характера 258 – 254 нм и 428 – 520 нм. Для алифатических кетон-денитрофенилгидразонов нейтрального характера спектр поглащения 363 – 367 нм, основного характера 430 – 434 и 524 – 535 нм. Образовавшиеся 2,4 – денитрофенилгидразоны регистрировали при следующих длинах волн: 356, 370, 430, 530 нм. Уровень карбонильных групп при длине волны 370 нм.

Общий белок определяли биуретовым методом (метод Кингслея – Вейксельбаума)[8].

Статистическую обработку полученных результатов производили с помощью программы MicrosoftExcel 2003 и Биостатистика вер. 4.03 методами параметрической статистики, включающей – определение средней арифметической (М) и стандартного отклонения. В таблицах и на графиках представлены средние значения и стандартные отклонения не менее чем 3 биологических повторностей, с 3 биохимическими повторностями в каждой из них.

Достоверность различий оценивали по tкритерию Стьюдента с поправкой Бонферрони. Уровень значимости достоверности различий – 95%[4].


Результаты и их обсуждения

В плазме крови кролика были выявлены продукты окисления белков, которые прореагировали с 2,4 – ДНФГ. Основное количество образовавшихсядинитрофенилгидразонов относится к альдегидо и кетонпроизводным нейтрального характера. Статистически значимой разницы в их содержании не выявлено (рис. 1,2,3)Альдегидо и кетонпроизводные основного характера в исследуемых образцах были ниже, в 1,5 раза, чем те же производные нейтрального характера (рис. 1,2,3). Существенной разницы в их содержании так же нет, однако содержание альдегидпроизводных основного характера во всех образцах было ниже, чем содержание кетонпроизводных того же характера. Содержание карбонильных группировок во всех образцах существенно ниже, чем содержание всех остальных фракций. На рис. 1 показано содержание различных продуктов окислительной модификации белков в плазме крови кролика при разных типах питания.

Рис. 1. Содержание различных продуктов окислительной модификации белков (ОМБ) в плазме крови кролика при разных типах питания.

ААДНФГНХ - алифатические альдегид-денитрофенилгидразоны нейтрального характера

ААДНФГОХ - алифатические альдегид-денитрофенилгидразоны основного характера

АКДНФГНХ - алифатические кетон-денитрофенилгидразоны нейтрального характера

АКДНФГОХ - алифатические кетон-денитрофенилгидразоны основного характера

КГ - карбонильные группы

На рисунке 1 видно, что содержание продуктов окислительной модификации белков в плазме крови при разных типах питания различное. Наибольшее количество окисленного белка выявлено при «традиционном» и «инновационном» типах питания, наименьшее при «естественном» типе питания. (Р<0,05) Между тем при сравнении «традиционного» и «инновационного» типов питания статистически значимой разницы не выявлено (Р>0,05). Такая картина, возможно, связана с тем, что при 2-х последних типах питания животные получали не достаточное количество «естественных» витаминов и антиоксидантов различной природы, что снижает их естественную, внутреннюю защиту от воздействия свободных радикалов. На основании полученных данных, а именно большего содержания окисленных метаболитов при «традиционном» и «инновационном» типах питания по сравнению с «естественным» и выдвинутым предположением о том, что это связано с отсутствием в пищи «естественных» антиоксидантов и витаминов мы решили проверить данную гипотезу. Для этого двум последним группам животных (с «традиционным» и «инновационным» типом питанием) вводили в пищу равное количество свежих растительных компонентов, которые содержат естественные антиоксиданты и витамины (сосновые и ивовые ветки, морковь, капуста, «сырая» трава) в течении 14 дней. При этом производили забор крови через 1, 3, 7 и 14 дней после введения в пищу соответствующих компонентов. На рисунке 2 и 3 показано изменение в содержание продуктов окисления белков, которые прореагировали с 2,4 – ДНФГ.

Рис. 2 Влияние «сырых» растительных компонентов на количество продуктов образовавшихся в процессе ОМБ плазмы крови кролика при «традиционном» типе питания (обозначения см. рис.1).

Рис. 3 Влияние «сырых» растительных компонентов на количество продуктов образовавшихся в процессеОМБ плазмы крови кролика при «инновационном» типе питания(обозначения см. рис.1).

При введении в рацион животных дополнительных добавок в виде «сырого» растительного сырья при «традиционном» и «инновационном» типах кормления в течение первых 3-х дней наблюдается не существенное изменение в содержании продуктов окислительной модификации белков, обнаруженных в их плазме крови, в сторону уменьшения (Р>0,05). Однако уже через неделю выявлено существенное уменьшение уровня всех фракций окисленного белка по сравнению с контролем, такая же картина наблюдается и после 2-х недель с начала эксперимента.(Р<0,05). Данная ситуация, а именно, незначительное изменение уровня окисленного белка в опытных образцах по сравнению с контролем на 1-й и 3-й дни после начала эксперимента возможно связано с тем, что антиоксиданты содержащиеся в добавках взаимодействуют с АФК и препятствуют процессу новообразования окисленных форм белка, но не могут восстановить уже имеющуюся окисленную форму, поэтому результаты в первые три дня статистически не отличаются от контроля. Снижение уровня окисленного белка в плазме крови кролика связана с действием протеаз, которые постепенно разрушают его, а антиоксиданты препятствуют деструкции «здоровой» белковой молекулы.

Рис. 4,5 Динамика изменения содержания различных продуктов ОМБ в плазме крови кролика при «традиционном» и «инновационном» типах питания (обозначения см. рис.1).

При исследовании влияния антиоксидантов, содержащихся в растительном сырье, на различные продукты окислительной модификации белков, установлено, что антиоксиданты во всех опытах снижали все фракции окисленного белка, (рисунок 4,5) это свидетельствует о единстве природы АФК участвующих в ОМБ, а так же о слаженной работе протеолитических комплексов.

Выводы
  1. Общее количество продуктовобразовавшихся в результате окислительной модификации белков при «естественном» типе питания было статистическизначительно ниже, чем при «традиционном» и «инновационном» типах.

  2. При добавлении «сырой» растительной пищи в рацион кроликов находящихся на «традиционном» и инновационном» типах питания наблюдается постепенное снижение, (в 1, 5 раза), продуктов окислительной модификации белков. При этом наблюдается в обоих случаях 2 пика снижения: краткосрочный в первые 3 дня, характеризующийся не значительным снижением продуктов окислительной модификации белков(Р>0,05) и долгосрочный (7 и 14 дней), при котором, видно явное уменьшение продуктов окислительной модификации белков по отношению к контролю(Р<0,05).


Литература:
  1. АрчаковА.И., МохосоевИ.М. // Биохимия – 1989 – Т.54, №2,-с.176-179

  2. Боярский Л.Г. Производство и использование кормов – М.: Росагропромиздат, 1988

  3. Владимиров В.Ю. Свободные радикалы и антиоксиданты. Вестник РАМН. 1988. №7. С.-43-51

  4. Гланц С. Медико-биологическая статистика М.:, Практика 1999., 459 с.

  5. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток, Санкт Петербург 2006, 396 с.

  6. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. // Биохимия – 1995 с. 24-26

  7. Игуменов В.Л., Шаров Б.П., Пасечник В.А. // Биохимия – 1988, - Т.53, №6, - с.925-929

  8. Мельников В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987., 367 с.

  9. Седов Ю.Д. Кролики разведение, содержание, уход, Ростов на Дону, сФеникс 2009 173 с.

  10. Томмэ М.Ф. Кормовые рационы и нормы кормления для сельскохозяйственных животных . – М.: Сельхозиздат, 1963

  11. Beppu M., Ynoue M., Yshikawa T., Kikugava K., Presence of membrane bound proteinases that preferentially degrade oxidatively damaged erythrocyte membrane proteins as secondary autioxidantdefeuse. Biochem.,Biophys., Acta/. 1994.,v. 1196 №1 P/ 81- 87

  12. Dubinina E.E., Babenko G.A., Sherbak S.G. // ibit. – 1992. – Vol. 13., №1-P.1-7

  13. Frey P.A. Radical mechanisms of enzymatic catalysis/ Anny. Rev. Biochem. 2001. V. 70. P. – 121 – 148

  14. Hikerji S.K., Pimstone N.R. //Arch. Biochem. – 1990. – Vol. 181. – P. 177 – 184

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle