Библиографическое описание:

Мовсум-заде С., Мехтиев А. Индуцирование мутации рыб блокадой серотонин-модулируемого антиконсолида¬ционного белка антителами // Молодой ученый. — 2010. — №6. — С. 77-81.

The article concerns studies of effect of decreased activity of serotonergic system on the level of mutagenic changes (micronucleus test) in gobies (Neogobius fluviatilis) and sturgeon juveniles (Acipen­ser gueldenstaedti persicus). It is shown that prolonged exposure of animals to the industrial and oil pollution leads to signi­ficant decrease of the level of serotonin-modulating anticonsolidation protein (SMAP) being in linear relationship with the serotonin level, in the liver and, simul­taneously, to acute elevation of Micronuclei level in erythrocytes. Intramus­cular administration of ant-SMAP polyclonal antibodies to the sturgeon juveniles induces significant increase of micronuclei amount in erythrocytes relatively to the group of animals injected with non-immune γ-globulins. The results give grounds to make a conclusion that downregulation of serotonergic system activity presents the mechanism launched by adverse environmental factors and realizing mutagenic damages in the modified genetic apparatus.  

Key words: serotonin-modulating anticonsolidation protein (SMAP), mutagenic changes, industrial and oil pollution, polyclonal antibodies to SMAP.

Неблагоприятные факторы окружающей среды различной природы вы­зы­вают значи­тельное изменение активности серотонинергической сис­темы в тканях животных. В частности, повышенная солёность воды (1%-ный рас­т­вор NaCl) приводит к резкому увеличению уровня серотонина и дофамина в структурах головного мозга мальков карпа [1]. хроническая экспозиция рыб в воде, содержащей примеси меди [2] и ртути [3], приводит к зна­чи­тель­ному снижению уровня серотонина в тканях животных. В иссле­до­ва­ниях, прове­денных на ракообразных, было показано, что дли­тель­ная экс­по­зи­ция живот­ных в воде, содержащей примеси тяжёлых метал­лов и органи­чес­ких соеди­нений, оказывает негативное воздей­ст­вие на обмен серо­тонина, при­­­­­­­во­дя к сни­­жению его уровня [4]. Вместе с тем, большин­ство неблаго­при­ятных фак­торов обладают способностью индуцировать мутаген­ные изме­нения в тка­нях [5, 6]. В этой связи представляет несомненный интерес изу­чение роли серото­нинергической системы в развитии мутагенных измене­ний.

Материалы и методы исследований

Работа выполнена на бычках (Neogobius fluviatilis), обитающих в при­бреж­ной зоне Каспийского моря и ведущих осёдлый образ жизни, и на  моло­ди осетров (Acipenser gueldenstaedti persicus). Бычки (по 7 особей) были вы­лов­лены в двух зонах – в относительно чистой и в зоне, характери­зую­щейся высоким уровнем загрязнения железом, цинком и полиаромати­чес­кими углеводородами. У животных брали про­бы крови из хвостовой вены, делали мазки на предметных стёклах, окраши­вали по Рома­новскому-Гимзе и под световым микроскопом подсчи­ты­­вали количество микроядер в 2000 эрит­ро­цитов, пересчитывая полученное коли­чество на 1000 клеток. Одно­вре­мен­но у животных забирали пробы печени, экс­трагировали водорас­творимые белки и определяли содержа­ние серото­нин-мо­дулируемого анти­кон­солида­цион­ного белка (СМАБ) методом твёрдо­фаз­ного иммунофер­мен­т­ного анали­за на поли­стироловых планшетах. При про­ве­де­нии ана­ли­за в ка­честве ан­ти­генов ис­поль­­зовали сум­мар­ные белки печени осетров, экстраги­ро­ванные в 0,05 М фос­фатном буфере (рН 7,2-7,4), со­державшем 0,3 М NaCl, 5 мМ ЭДТА и 0,1%-ный тритон Х-100 и доведённые до концен­трации 20 мкг/мл с помо­щью 0,1 М буфера трис-HCl (pH 8,6). Каждую пробу дубли­ро­вали триж­ды и по завершении реакции вычисляли среднюю арифметическую из значений трёх проб. Кон­центрацию белка определяли по ме­то­ду Бредфорд с ис­поль­­­зо­вани­ем 0,01%-ного раст­вора Кумасси брил­ли­ан­то­вого синего G-250, на длине волны 595 нм [10]. в качестве пер­вых ан­ти­­тел ис­поль­зова­ли кроли­чьи им­му­но­гло­булины к белку СМАБ, а в ка­честве вто­рых анти­тел – проти­во­­кроличьи козьи имму­но­гло­бу­лины с ко­нъю­ги­ро­ванной пер­­­ок­си­дазой хре­на. Визуа­лиза­цию реа­к­ции осу­щес­твляли с по­мо­­щью суб­с­трата перок­сидазы хре­на – 0,05%­­­­ -ного рас­тво­ра ортофе­ни­лен­ди­амина в 0,05 М цитрат-фосфат­ном буфе­ре (pH 4,5). Реак­цию останав­лива­ли че­­рез 20 мин после добавления субстрата путем прили­ва­ния в лунки 3 М рас­твора NaOH, а резуль­таты реа­к­ции счи­тывали на фо­то­метре для им­му­но­­фер­мен­тного анализа “StatFax 303” (Aware­ness, США) на длине вол­ны 492 нм. Результаты исследования усред­няли по группам и срав­нивали по t–критерию Стьюдента.

Во второй серии экспериментов, выполненных на годо­валой молоди осетров, жи­вотных разбили на 3 группы: 1) группа интактных животных (n=7); 2) группа жи­вот­ных, находившихся в тече­ние 5 сут в пресной воде, со­дер­жав­шей нефть из месторождения «Неф­тяные кам­ни» в концентрации 100 мг/л (n=7); 3) группа животных, находившихся в те­че­­ние 15 сут в пре­сной воде, содер­жав­шей нефть в той же концентрации (n=7). По завер­шении экс­пе­­риментов у осетров брали пробы крови из хвостовой вены для про­ведения микро­ядер­ного теста, а так­же пробы печени для определения уровня СМАБ методом иммунофер­мен­тного анализа. Результаты исследования усред­няли по группам и срав­нивали по t–критерию Стьюдента.

В третьей серии исследования также осуществляли на молоди осетров ве­сом 10-15 г и были использованы 3 группы животных: 1) группа интактных жи­вотных (n=11); 2) группа животных (n=10), которым внутримы­шеч­но вво­дили кроличьи неиммунные γ-глобулины в концентрации 1,5 мг/мл и объёме 0,7 мл (в целях контроля неспецифических эффектов гетеро­логи­ческих анти­тел); 3) группа жи­вотных (n=9), которым вводили кроличьи поликло­нальные антитела к белку СМАБ в таком же количестве. Антитела к СМАБ очищали из раствора иммуноглобулинов, полученных в результате 5-6-месяч­ной им­му­­­ни­за­ции кроликов этим белком, методом аффинной хромато­графии на ко­лонке CNBr-сефарозы с предварительно иммобилизованным СМАБ. СМАБ вы­де­ляли в препаративных количествах из головного мозга быка описанным ранее способом [7]; гомогенность выделенного белка оцени­вали методом электрофореза в полиакриламидном геле в трис-глициновой буферной систе­ме (рН 8,3). Инъек­ции неиммунных γ-глобулинов и анти­тел молоди осетров осу­щес­твляли дважды: в 1-ый день и через 24 ч. На 3-ьи сут после первой инъекции у животных из хво­­­стовой вены забирали пробы крови для про­ве­дения микроядерного теста. Результаты исследования усред­няли по группам и срав­нивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

СМАБ был ранее идентифицирован в коре головного мозга и вы­де­лен из це­лого мозга крыс, оп­ре­де­лены его физико-химические свойства и участие в инте­г­ратив­ной дея­тель­но­сти нер­в­ных клеток, в частности, в процессе консо­лидации следов памяти  [7]. Биохи­мическими исследо­вани­я­ми, выполнен­ны­ми на коре голо­в­но­го мозга нарко­ти­зированных крыс [7, 8], и эл­ек­тро­фи­зио­ло­ги­чес­кими ис­сле­дова­ни­ями, связанными с регистрацией нейрональной ак­тив­ности на иден­ти­­фи­ци­рованных команд­ных нейро­нах моллю­сков [9], было показано, что со­дер­жа­ние СМАБ в нер­вных клетках жи­вот­ных нахо­дится в пря­мой зави­симости от уровня серо­тонина. Указанный факт поз­во­ляет оце­ни­вать внутриклеточную актив­ность се­ро­то­нин­­ерги­чес­кой сис­те­мы по уров­ню СМАБ в исследуемых тканях, а также целе­на­п­равленно воз­дей­ствовать на активность этой системы путём введения в организм самого бел­ка или анти­тел к нему.

В результате проведенных исследований на бычках было установлено, что в микроядерном тесте количество микроядер в эритроцитах рыб из за­гряз­нённой зоны значительно превышало их количество у животных из чис­той зоны (p<0,001; Рис.1А). При изучении содержания СМАБ в печени быч­ков было обнаружено его значительное снижение у животных, вылов­лен­ных из загрязнённой зоны, по сравнению с животными  из чистой зоны (p<0,001; Рис. 1Б).


В модельных экспериментах при экс­позиции молоди осетров в загряз­нён­ной нефтью воде в течение 5 сут не от­ме­чалось увеличения уровня мик­ро­ядер в эритроцитах (Рис.2А). При этом уро­вень СМАБ в печени под­опыт­ных животных не отличался от контрольного (Рис. 2Б). В то же время в груп­п­­е животных, содер­жав­шихся в загрязнённой неф­тью воде на протяже­нии 15 сут, наблюдалось резкое увеличение коли­чества мик­ро­ядер в эритро­цитах (p<0,01; Рис. 2A), сопровождавшееся замет­ным сниже­нием уровня СМАБ в печени (p<0,01; Рис. 2Б).

 

Результаты проведенных исследований позволили придти к заключению о том, что при воздействии на организм неблагоприятных факторов сниже­ние активности серотонинергической системы в тканях орга­низма является неотъемлемой частью возрастания уровня мутагенных изме­не­ний. Для выяв­ления роли активности серотонинергической системы в формировании мута­генных изменений в тканях были проведены эксперименты, в которых осу­щес­твляли избирательную блокаду активности СМАБ с помощью поликло­нальных анти­тел.

В этих экспериментах двукратное внутримышечное введение антител к СМАБ приводило к значительному увеличению (на 56%) количества микро­ядер в эритроцитах мо­лоди осе­т­ров по сравнению с животными, которым в таком же количестве вво­дили не­им­­мунные γ-глобу­лины (p<0,01; Рис. 3). При этом, введение неим­мунных γ-глобу­линов вызывало увеличение уровня мик­ро­ядер в эритроцитах относительно этого показателя интак­тных живот­ных (p<0,05; Рис. 3), свидетель­ст­ву­­ющее о наличии токсических эф­фек­­­­тов у ис­поль­зо­ван­ных гетерологи­чес­ких неиммунных γ-глобу­линов и ан­ти­тел. Полу­чен­­ные результаты продемон­ст­ри­ро­вали, что инги­би­рование ак­тив­но­сти се­ро­­тонинергической сис­темы ин­ду­ци­рует возник­новение мутаген­ных изме­не­ний в тканях и что сниже­ние актив­ности этой системы мо­жет ле­жать в ос­но­ве меха­низма фор­миро­ва­ния мута­ций в клетках различных тканей при воз­действии на орга­низм небла­го­при­ят­ных факторов окру­жающей среды.


Из литературы известно, что формирование микроядер в результате воз­действия на организм живот­ных неблагоприятных факторов происходит в пе­ри­­од кле­точного деления [11, 12, 13]. Возможно, это обусловлено большей уязвимостью хроматина в связи с кон­фор­мацион­ными перестройками, кото­рые он претерпевает в этот период кле­точного цикла. В тканях зрелого орга­низма пролиферативная активность кле­ток, как извест­но, снижена. вместе с тем, вследствие того, что серо­то­нин реа­лизует свои фун­­кции внутри клеток посредством модуляции актив­ности от­дельных генов [14], снижение его уровня под влиянием неблагоприятных фак­торов, вероятно, будет спо­соб­ствовать вклю­чению генов, которые активно функци­они­руют на эм­бри­ональ­ных ста­диях развития, что приведёт к обрете­нию зре­лыми клетками свой­ств, присущих эмбриональ­ным, в част­ности, вы­со­кой про­ли­феративной актив­но­сти. В условиях эксперимента бы­ла, в част­ности, про­де­монстри­ро­вана спо­собность миобластов мышей к де­диф­­фе­рен­ци­ации с утра­той ими спе­ци­фи­чес­ких миогенных мар­керов (MyoD и мио­зин) и предот­вращением наступ­ления последующих эта­пов клеточной дифферен­циации – форми­рова­ния мышеч­ных трубок [15]. Из сказанного сле­дует, что образование мик­ро­ядер в условиях воздействия на организм небла­­­го­при­ятных фак­торов может быть обусловлено опосредованное сни­женным уров­нем ак­тив­­ности се­­­­­­ро­­тонинер­гической системы переключением работы зре­лых кле­ток на ре­жим высокой митотической активности, по­вы­­­­шающей риск воз­ник­нове­ния му­тагенных повреждений генетического аппарата.

Подтверждением пра­во­мочности предложенного механизма возникно­ве­ния мутагенных измене­ний под влиянием неблагоприятных факторов явля­ются результаты воздей­ствия антител к СМАБ на уровень микро­ядер у мо­лоди осетров. Целью данной серии исследований являлось моделирование влияния неблагоприятных факторов на уровень микроядер путём одного толь­­ко искус­ст­венного снижения активности серотонинергической системы. Значительное увеличение уровня микроядер в эритроцитах в условиях бло­ка­ды СМАБ ан­тителами отно­сительно группы животных, которым вводили кро­личьи неим­мунные γ-глобулины (что, таким образом, исключает неспе­ци­фический ха­рак­тер эффектов ге­теро­ло­гичных антител), сви­­­детельствует о том, что сни­жение уровня СМАБ в пече­ни бычков и осетров, под­вер­гнутых длитель­ному воздействию промышленного и нефтяного загрязнения, носит не сопут­ству­ющий харак­тер, а, вероятно, является меха­низмом, запус­каемым небла­го­при­ятными фак­то­рами и реализующим мута­генные поломки в моди­фици­рован­ном генети­ческом аппарате.

В рамках описанной схемы становятся понятными результаты ранее проведенных исследований, в которых был продемонстрирован антимута­ген­ный ха­рактер вли­я­ния экзогенно введённого СМАБ, повышающего вну­три­кле­точ­ную актив­ность серотонинергической системы [16]. В этом случае, пре­д­­ва­­рительное введе­ние СМАБ молоди осетров, подвергнутым воз­дей­ст­вию небла­гоприятных факторов химической природы, вероятно, индуциро­вало пе­ре­вод клеток в фазу митотического покоя и соот­вет­ству­ющие конфор­ма­ци­онные пере­­ст­ройки хроматина, обеспечиваю­щие его защи­ту от мута­ген­ных повреждений.  

Литература

1.      De Boeck G., Nilsson G.E., Vlaeminck A., Blust R. Central monoaminergic res­ponses to salinity and temperature rises in common carp // J. Exper.Biol. 1996. V. 199, № 7, p.1605-1611.

2.       Handy R.D. Chronic effects of copper exposure versus endocrine toxicity: two sides of the same toxicological process?// Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrated Physiology, 2003, V. 135, № 1, pp. 25-38.

3.      Tsai C.L., Jang T.H., Wang L.H. Effects of mercury on serotonin concentration in the brain of tilapia, Oreochromis mossambicus.// Neurosci Lett., 1995, V. 194, № 3, pp.208-211.

4.      Fingerman M., Jackson N. C. and Nagabhushanam R. Hormonally-regulated functions in crustaceans as biomarkers of environmental pollution.// Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrynology, 1998, V. 120, № 3, pp. 343-350.

5.      Nepomuceno J.C., Ferrari I., Spano M.A., Centeno A.J. Detection of micro­nuc­lei in peripheral erythrocytes of Cyprinus carpio exposed to metallic mer­cury.// Environ. and Mol. Mutagenesis. 1997, V. 30, № 3, pp. 293-297.

6.      Bickham J.W., Sandhu S., Herbert P.D.N., Chikhi L., Athwal R. Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural populations: implication for biomonitoring and ecotoxicology.// Mutation Res., 2000. V. 463, p. 33-51.

7.      Мехтиев А.А. Обнаружение в головном мозге крыс белка, обладающего ан­­ти­консолидационными свойствами // Бюллетень экспер. биол. мед. 2000. т. 129,  № 8, с. 147-150.

8.      Гасанов Г.Г., Мехтиев А.А. Выявление серотонин-модулируемой бел­ковой фракции и изучение её участия в организации поведения пассивного избегания // Бюллетень экспер. био­л. мед., 1991, т. 112, № 7, с. 5-7.

9.      Мехтиев А.А., Козырев С.А., Никитин В.П., Шерстнёв В.В. Изби­ра­тельное влияние антител к белку SMP-69 на активность коман­дных нейронов оборонительного поведения виноградных ули­­ток // Российский физиол. журнал им. И.М.Сеченова, 2003, т. 89, № 4, с. 389-396.  

10.  Скоупс Р. Методы очистки белков. М., 1985, с. 173-178.

11.  Paglin S., Delohery T., Erlandson R., Yahalom J. Radiation-induced micro­nuclei formation in human breast cancer cells: dependence on serum and cell cycle distribution // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 237, № 3, P. 678-684.

12.   Kasuba V., Rozgaj R.. Micronucleus distribution in human peripheral blood lymphocytes treated in vitro with cadmium chloride in G0 and S phase of the cell cycle // Chemosphere. 2002. V. 49, № 1, P. 91-95.

13.   Banasik A., Lankoff A., Piskulak A., Adamowska K., Lisowska H., Wojcik A. Aluminum-induced micronuclei and apoptosis in human peripheral-blood lym­phocytes treated during different phases of the cell cycle // Environ. Toxicol. 2005. V. 20, № 4, P. 402-406.

14.  Barziali A., Kennedy T.E., Sweatt J.D., Kandel E.R. 5-HT modulates protein synthesis and the supression of specific proteins during long-term facilitation in Aplysia sensory neurons.// Neuron. 1999, V. 2, p. 1577-1586.

15.  Chen Sh., Zhang Q., Wu X, Schultz P.G., Ding Sh. Dedifferentiation of lineage-committed cells by a small molecule // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126, № 2, p. 410-411.

16.   Мехтиев А., Мовсум-заде С. Антиму­та­генная активность серотонин­ергической системы и подлежащие механизмы у молоди осетров (Acipen­ser gueldenstaedti persicus) и серебряных карасей (Carassius auratus).// Журнал эволюц. биохимии и физиологии. 2008, т. 44, № 5, c.476-481.

 

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle