Библиографическое описание:

Романова М. А., Додонова А. Ш. Изучение цитотоксичности биологически активных соединений на культуре клеток // Молодой ученый. — 2016. — №18. — С. 110-114.



В обзоре представлены данные о том, какая роль отводится клеточным культурам при изучении цитотоксичности биологически активных соединений. Изучение биологической активности веществ, независимо от последующей цели их использования, как правило, на первом этапе предполагает оценку их токсичности. Методы оценки токсичности, альтернативные классическим тестам на экспериментальных животных, а именно, модели с использованием культур клеток находят все более широкое применение в биохимико-токсикологических исследованиях.

Ключевые слова: цитотоксичность, биологическая активность, культура клеток, биологические тест-системы

Клеточные культуры с каждым годом находят все большее применение в самых разнообразных областях биологии, медицины и сельского хозяйства. Их используют при решении таких общебиологических проблем, как выяснение механизмов дифференцировки и пролиферации, взаимодействия клеток со средой, адаптации, старения, биологической активности, злокачественной трансформации и многих других.

Важная роль отводится клеточным культурам в биотехнологии при производстве вакцин и биологически активных веществ. Культуры клеток применяются для диагностики и лечения наследственных заболеваний, в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ, а также для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений [1].

Многие достижения фундаментальных и прикладных исследований в биологии и медицине тем или иным образом зависели от опытов на животных. Начиная с 80-х годов 20 века для минимизации количества подопытных животных или полной их замены для изучения токсичности различных препаратов и соединений используются альтернативные биологические модели. Одной из таких моделей являются культуры клеток [2–7]. Культуры клеток человека и животных в качестве биологических тест-систем все чаще используются исследователями ввиду простоты их культивирования, возможности контроля и большей воспроизводимости по сравнению с тест-системами in vivo. К тому же немаловажную роль играют сокращение временных и экономических затрат. Основное же преимущество культивируемых клеток — это возможность прижизненного визуального наблюдения клеток, сохраняющих жизнеспособность в течение всего эксперимента, с помощью микроскопа. Единственный нюанс — это требования к стандартизации качества культуры клеток и тканей [8].

Изучение биологической активности веществ, независимо от последующей цели их использования, как правило, на первом этапе предполагает оценку их токсичности. Методы оценки токсичности, альтернативные классическим тестам на экспериментальных животных, а именно, модели с использованием культур клеток находят все более широкое применение в биохимико-токсикологических исследованиях [9]. Такие методы позволяют помимо решения этических проблем, связанных с массовым использованием и гибелью экспериментальных животных, значительно удешевить и сократить сроки предварительного исследования новых препаратов, прежде всего на стадии их доклинических испытаний. Еще одно преимущество моделей in vitro заключается в возможности работы непосредственно на культурах клеток человека, что делает полученные данные более адекватными при их проекции на организм человека. Кроме того, использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне. [10].

Несмотря на широкое развитие и признание альтернативных методов в мире, у нас в стране они пока не получили должного распространения [11].

Если обратиться к истории, то еще в 1959 году микробиолог R. Birch и зоолог W. Russel в Лондоне издали книгу общепризнанных принципов гуманного использования животных в исследовательских и образовательных целях «The principle of humane experimеntal technique», в которой была сформулирована концепция «трех R» (Replacement, Reduction, Refinement). В данной концепции Replacement (замена) означает замену на методы, позволяющие достичь цели без проведения экспериментов на животных. Reduction (сокращение) включает методические подходы, позволяющие получать сравнительную информацию при использовании меньшего числа животных или получения большего количества данных на том же количестве животных. Refinement (усовершенствование) включает методы, исключающие или вызывающие минимальную боль, страдания и стресс у животных.

В течение почти 50 лет концепция «трех R» была кодифицирована в законы, стандарты и руководящие документы во всем мире.

Сегодня концепция «трех R» является самой передовой в области научных исследований. Благодаря этой концепции удалось сконцентрировать на данной проблеме внимание правительств и академических центров, что привело к существенному изменению техники исследований, испытаний и обучения с пользой как для науки, здоровья общества и образования, так и в интересах защиты экспериментальных животных [12, 13].

Всемирная организация здравоохранения, международное медико-биологическое общество не только одобряют, но и настоятельно рекомендуют и поддерживают использование альтернативных моделей и методов в токсикологии. Эксперименты в условиях in vitro становятся повседневной практикой в деятельности научно-исследовательских институтов экологического и гигиенического профиля, органов, контролирующих состояние окружающей среды [14].

Внедрение альтернативных методов в токсикологические исследования происходит под контролем таких международных организаций, как Европейский центр по утверждению альтернативных методов, Интернациональный комитет центра по утверждению альтернативных методов, Европейское сообщество токсикологов in vitro и других.

Следует отметить, что крупный вклад в развитие нового направления — клеточной токсикологии внес выдающийся шведский ученый, цитолог доктор Bjorn Ekwall. Сформулированная им в 1983 году концепция так называемой «базовой цитотоксичности» (basal cytotoxicity) лежит в основе использования тестов на культуре клеток для определения острой токсичности веществ вместо тестов на животных. Чтобы на практике проверить свои теории, Bjorn Ekwall организовал международный токсикологический проект под названием MulticentreEvaluationofInVitroCytotoxicityProgramm [15].

Работая над данным проектом, BjornEkwall выделил 3 типа токсичности.

Под цитотоксичностью понимают появление патологических изменений в клетках при действии физических, химических и биологических агентов. В зависимости от силы и мишени воздействия возможна широкая гамма изменений, ограниченная с одной стороны цитостатическим эффектом, нарушающим прохождение клетки по клеточному циклу, а с другой стороны — цитоцидным эффектом, ведущим клетку к гибели [16]. Если рассматривать клеточную гибель как конечный результат цитотоксического действия перечисленных выше агентов, то под цитотоксичностью можно понимать разнообразные нарушения, имеющие на одном фланге запуск механизмов апоптоза, а на противоположном фланге — включение процессов некроза [17].

Базовая (общая) цитотоксичность — неблагоприятное воздействие веществ на общие для всех клеток структуру и функции, необходимые для выживания клетки, деления, репликации ДНК и т. д. Общая цитотоксичность характеризуется одинаковой чувствительностью к действию вещества независимо от типа клеток.

Органоспецифическая цитотоксичность — влияние на структуры и функции, специфические для определенных клеток тканей и органов, (например, в результате воздействия процессов биотрансформации, связывания со специфическими рецепторами). Для ее определения используются тесты на клеточных линиях различных тканей органов (кровь, печень, почки и т. д.).

Внеклеточная токсичность — проявляется, если исследуемые образцы непосредственно не влияет на клетку, но его действие критическое на уровне целостного организма и охватывает процессы, происходящие вне клеток (например, клеточная секреция). Автор указывал, что все три типа цитотоксичности могут иметь место invivo, поэтому должны учитываться в стратегии исследований invitro [18].

Для проведения опытов in vitro обычно используются клетки животных или человека, взятые вне организма животного. В переводе это словосочетание обозначает «в стекле» и обозначает процедуры, выполняемые на живом материале или компонентах живого материала, выращенных на культуре в чашках Петри или пробирках в определенных условиях. Они противоположны опытам in vivo, то есть проводимых «на живых животных». Хотя достаточно трудно, если вообще возможно, проецировать эффекты веществ на сложный организм, если наблюдения ограничены одним видом клетки в чашке, тем не менее, опыты in vitro позволяют получить достаточно информации о врожденной токсичности, а также клеточных и молекулярных механизмах токсичности. Кроме того, они дают ряд преимуществ по сравнению с опытами in vivo, так как, в целом, менее дорогостоящи и могут проводиться в условиях, которые более строго контролируются. Несмотря на то, что небольшое количество животных необходимо для получения клеток для выращивания культур in vivo, эти методы могут рассматриваться как альтернативы по снижению (требуется меньше животных, чем в опытах in vivo) и усовершенствованию (устраняют необходимость подвергать животных вредным токсическим воздействиям во время опытов in vivo).

Для интерпретации результатов опытов токсичности in vitro, определения их потенциальной роли в оценке токсичности и установления связи с общими токсикологическими процессами in vivo, необходимо понимать, какая часть токсикологического процесса изучается. Общий токсикологический процесс состоит из событий, которые начинаются с момента воздействия на организм физического или химического агента, затем следуют клеточные и молекулярные взаимодействия, которые в конечном итоге проявляются в ответной реакции всего организма. Опыты in vitro, как правило, ограничены частью токсикологического процесса, происходящего на клеточном и молекулярном уровне. Виды информации, которые можно получить из опытов in vitro, включают пути попадания и метаболизм, взаимодействия активных метаболитов с клеточными и молекулярными мишенями, и поддающиеся измерению токсические конечные результаты, которые могут служить в качестве молекулярных биомаркеров воздействия. В идеальном случае, механизм токсичности каждого вещества с момента воздействия до проявления организмом признаков токсичности должен быть изначально известен с тем, чтобы информация, полученная в результате опытов in vitro, могла быть полностью интерпретирована и связана с ответной реакцией всего организма. Однако это практически невозможно, так как досконально изучены лишь относительно небольшое число токсикологических механизмов. Таким образом, токсикологи сталкиваются с ситуацией, когда результаты опытов in vitro не могут быть использованы для абсолютно точного прогнозирования токсичности in vivo, поскольку механизмы неизвестны. Вместе с тем, в процессе развития опытов in vitro происходит дальнейшее изучение клеточных и молекулярных механизмов токсичности.

Для исследования цитотоксичности на культуре клеток рекомендованы следующие тесты [19]:

Относительно простым анализом цитотоксичности является тест MTT. МТТ — это 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н тетразоловый краситель, который под воздействием ферментов митохондрий приобретает синюю окраску. Только клетки с живыми митохондриями могут осуществлять эту реакцию, следовательно, интенсивность окраски прямо связана со степенью не поврежденности митохондрий. Этот тест полезен для обнаружения общих цитотоксических соединений, а также агентов, для которых митохондрии являются специфическими мишенями.

Измерение активности лактатдегидрогеназы (LDH) также используется как основа различных опытов цитотоксичности. Этот фермент обычно присутствует в цитоплазме живых клеток и выделяется в среду клеточной культуры через протечки через мембраны мертвых или умирающих клеток, нарушенные под воздействием токсического агента. Небольшие количества культурной среды можно извлекать в различные промежутки времени после химической обработки клеток для измерения высвобожденной LDH и определять временной характер токсичности. По мере выделения LDH происходит общая оценка цитотоксичности; данный тест полезен, так как его легко проводить в реальное время.

Кроме выше перечисленных методов довольно часто применяются такие тесты: определение количества жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего; определение содержания общего белка, как показателя прироста клеточной массы (тест с сульфородамином В), который также может быть показателем клеточной пролиферации; оценка лизосомальной активности и интенсивности процессов активного мембранного переноса по поглощению красителя нейтрального красного; определение нарушения регуляции ионного состава (рН среды); оценка нарушения процессов метаболизма (определение активности глутатион-S-трансферазы); определения содержания АТФ в клетках и инкубационной среде; оценка морфологических изменений клеток [20].

Один из ключевых нерешенных вопросов, связанных с разработкой и внедрением опытов in vitro, связан со следующим соображением: должны ли опыты быть основаны на механизмах или достаточно быть описательными? Бесспорно, с научной точки зрения разумно использовать только опыты, основанные на механизмах в качестве замены опытам in vivo. Однако при неполном знании механизмов перспектива развития опытов in vitro для полной замены опытах на животных в ближайшем будущем практически равна нулю. Это, тем не менее, не исключает использования более описательных видов анализов, таких как скрининг-тесты, что и происходит сегодня. Благодаря скрининг-тестам удалось резко сократить количество опытных животных. Поэтому до тех пор, пока не будет собрана дальнейшая информация о механизмах, возможно, сохранится необходимость ограниченного проведения опытов, результаты которых будут просто коррелировать с данными, полученными в опытах in vivo [21].

Подводя итог вышеизложенному, можно сделать вывод о том, что метод культуры клеток является достаточно информативным для оценки общей цитотоксичности соединений, а также выявления их специфической токсичности. Высокая технологичность процесса исследований позволяет проводить скрининг одновременно нескольких веществ и непосредственно на клетках органов и тканей человека. Использование различных линий клеточных культур позволяет выбрать объект для исследования и изолированно изучать специфику токсического действия вещества на клетки различных органов и тканей (гепато-, нейро-, иммунотоксичность и др.).

Литература:

  1. О. В. Блажевич. Культивирование клеток. Минск, 2004. 1–8с.;
  2. Червонская Г. П. Культура клеток — альтернативная биологическая модель в токсикологических исследованиях // Тез. докл. 1 съезда токсикологов России. — М., 1998. — С. 328.
  3. Дядищев Н. Р., Рыбалкин С. П., Марченко А. И. Биологические модели in vitro в токсикологии // Тез. докл. 1 съезда токсикологов России. — М., 1998. — С. 276.
  4. Еропкин М. Ю., Еропкина Е. М. Культуры клеток как модельная система исследования токсичности и скрининга цитопротекторных препаратов. — СПб.: Морсар АВ, 2003. — С. 239.
  5. Botham P., Lewis R. Development of in vitro techniques for irritancy testing // Hum. and Exp. Toxicol., 1996. — V. 15, № 2. — P. 141.
  6. Hurna E. In vitro metody a ich vyuzitie v toxikologii // Vet.med., 2003. — V. 42, № 7. — P. 213–215.
  7. Combes R., Balls M. Ethical investment what is it, and what are the implications for industry funding of research into alternatives? // ATLA, 2001. — V. 29, № 1. — P. 55–62.
  8. Hartung T., Gstraunthaler G., Coecke S. et al. Good cell culture practice (GCCP) —an initiative for standardization and quality control of in vitro studies. The establishment of an ECVAM Task Force on GCCP // ALTEX. -2001. -V. 18, № 1. — P. 75–78.
  9. Maier K. L., Mateikova E., Hinze H. et al. Different selectivities of oxidants during oxidation of methionine residues in the a-1-proteinase inhibitor // FEBS Lett. 1989. — V.250, No.3. — P.221–226.
  10. Скулачев В. П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода // Соросовский образоват. ж. 2001. — № 6. — С.4–10.
  11. Березовская И. Б., Митрохин Н. М. Экспресс-методы определения острой токсичности // Бюлл. Всес.научного центра по безопасности биологически активных веществ. М., 1990. — С.45–67.
  12. Коршун М. Н., Краснокутская Л. М. Принцип Трех R и пути его реализации в токсиколого-гигиенических исследованиях / М. Н. Коршун, Л. М. Краснокутская // Український журнал з проблем медицини праці. — 2005. — № 3–4. — С. 66–74.
  13. Schuppli C. A., Fraser D. The interpretation and application of the three Rs by animal ethics committee members.-ATLA. — 2005. –V.33, № 5. — P.487–500.
  14. Ускоренное изучение цитотоксического действия в экспресс-тестах invitro / Завьялов Н. В., Червонская Г. П., Панкратова Г. П. и др. // Сб. тезисов докл. 1-го съезда токсикологов 17–20 ноября 1998, Москва. — 1998. — С. 279.
  15. Ekwall B. Correlation between cytotoxicity in vitro and LD50 values / B. Ekwall // Acta Pharmacologies Toxicologica. — 1983. — V. 52, S. II. — P. 80–99.
  16. Zimmerman H. J. Hepatotoxicity: The adverse effects of drugs and other chemicals on the liver, 2nd ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins. — 1999. — P. 789.
  17. Thompson C. B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science. 1995. — P. 267.
  18. EDIT: a new international multicentre programme to develop and evaluate batteries of in vitro tests for acute and chronic systemic toxicity / Ekwall B., Clemedson C., Ekwall B. [et al.] // ATLA. — 1999. — V. 27. — P. 339–349.
  19. Дмитруха Н. М., Короленко Т. К., Марченко М. Л. Застосування методу культури клітин в токсикологічному експерименті / Н. М. Дмитруха, Т. К. Короленко, М. Л. Марченко // Сучасні проблеми біоетики. — К.: Академперіодика, 2009. — С. 166–171.
  20. Еропкин М. Ю., Еропкин Е. М. Ферментативные методы оценки цитотоксичности на модели клеток человека в культуре: динамика лактатдегидратазы и глутатиондегидратазы под действием различных концентраций ДДС-Na / М. Ю. Еропкин, Е. М. Еропкин // Токсикологический вестник. — 1997. — № 5. — C. 26–32.
  21. ZurloJ.Токсикологические анализы inVitro // Токсикология. — 2014. — С. 303.

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle