Библиографическое описание:

Мезен Н. И., Корсик В. Ю., Шевчик Н. С. Некоторые особенности молекулярной эволюции изменения транскрипционных факторов Klf4 и Oct4, регуляторов плюрипотентности // Молодой ученый. — 2016. — №5. — С. 221-224.



Конец ХХ века ознаменовался крупными достижениями молекулярной и клеточной биологии, которые создали предпосылки для применения принципиально новых эффективных технологий при лечении различных заболеваний. Успешная разработка методов выделения и длительного культивирования стволовых клеток открыли широкие перспективы для применения их в медицине. Последние достижения современной биотехнологии и генной инженерии готовят мировую науку врачевания к величайшему прорыву в истории: посредством пересадки СК излечивать тяжелейшие недуги.

В этой связи кажется разумным упомянуть Нобелевскую премию по физиологии и медицине 2012 года. Её получили Джон Гардон (John B. Gurdon) и Шинья Яманака (Shinya Yamanaka) «за открытие факта, что зрелые клетки могут быть «перепрограммированы» обратно в плюрипотентное состояние».

Эта работа показала исключительную роль транскрипционных факторов в поддержании плюрипотентности клеток нашего организма [2]. Ключевую роль в реализации данного явления играют транскрипционные факторы Klf4 и Oct4. Зная первичную структуру этих белков и используя методы молекулярной эволюции, представляется возможным проследить закономерности эволюции этих белков.

Цель: Изучение эволюционных изменений белков Klf4 и Oct4 млекопитающих.

Задачи исследования:

  1. Провести множественное выравнивание полученных из базы данных NCBI аминокислотных последовательностей транскрипционных факторов Klf4 и Oct4 млекопитающих.
  2. Оценить скорость молекулярной эволюции исследуемых белков.

Материал и методы.

В работе использовались материалы Национального центра биотехнологической информации США, NCBI. Для последующего анализа были взяты полностью секвенированные аминокислотные последовательности 9 видов класса Млекопитающие в случае белка Klf4(Homo sapiens, Pteropus alecto, Sus scrofa, Bos taurus, Mustela putorius furo, Dasypus novemcinctus, Ceratotherium simum simum, Tursiops truncatus, Orcinus orca) и 8 видов для Oct4 (за исключением Tursiops truncatus ). Выбор данного класса обусловлен полнотой расшифровки исследуемых последовательностей. Дальнейшая работа проводилась поэтапно.

Первый этап представляет собой множественное выравнивание анализируемых сиквенсов. Выравнивание аминокислотных — процесс сопоставления сравниваемых последовательностей для такого их взаиморасположения, при котором наблюдается максимальное количество совпадений аминокислотных остатков.Множественное (выравнивание трех и более последовательностей) позволяет выявить более слабое сходство последовательностей, обеспечивает информацию для разбиения последовательностей на подгруппы, позволяет выделить вырожденные функциональные мотивы. Этап проводился в пакете программ MEGA 6 по алгоритму ClustalW [3].

Второй этап заключается в расчёте эволюционных дистанций. Для вычисления был использован метод дистанции, основанной на модели равных вставок (EIM-дистанции). В основе метода заложены следующие принципы: равная скорость замен в различных сайтах, учет сильной вариации частот аминокислот в белках, учет картины замен аминокислот. EIM-дистанция определяется по формуле:

,

где b = 1 − Σigi2, gi = частота аминокислоты i. PС-дистанция, дистанция Кимуры и EIM-дистанция также измеряются числом замен на аминокислотный сайт.

Третьим заключительным вычислительных этапомстал этап расчета средней скорости молекулярной эволюции. Средняя скорость эволюции рассчитывалась по методике, предложенной Е.В. Барковским в 2005 году, как среднее арифметическое от скоростей эволюции попарно сравниваемых дивергировавших видов. Вычисления проводились по формуле (где d- средняя эволюционная дистанция, а t — время дивергенции видов (по данным С. Кумар и соавторов):

Таблица 1

Общепринятые в молекулярной эволюции времена дивергенции различных таксономических групп

Дивергировавшие организмы

Время дивергенции, млн. лет назад

человек/парнокопытные

92

человек/китообразные

93,5

человек/непарнокопытные

94

человек/хищные

94

человек/рукокрылые

100

человек/броненосцы

129

Результаты и обсуждение

Для удобства восприятия изменения скоростей в эволюционном ряду нами были построены точечные графики с применением линейной аппроксимации (рисунки 1 и 6 для белков Klf4 и Oct4 соответственно).

Рис. 1. График зависимости эволюционных дистанций белка Klf4 млекопитающих от временами их дивергенции

Рис. 2. График зависимости эволюционных дистанций белка Oct4 млекопитающих от временами их дивергенции

Наглядной иллюстрацией полученных результатов можно считать представленную гистограмму. Горизонтально исчерченный столбец которой есть ничто иное, как медианная скорость эволюции рассчитанная для 60 различных белков (0,74 По). Серые столбцы — скорости молекулярной эволюции для белков разной степени консервативности. Диагонально исчерченные столбцы — полученные в ходе работы значения скоростей молекулярной эволюции для белков KLf4 и Oct, равные 0,22 По и 0,36 По соответственно. Данные о медианной скорости и скоростях эволюции алкоголдегидрогеназы класса 3 (0,25 По), панкреатической рибонуклеазы (2,1 По), креатинкиназы (0,18 По) и гистона H4 (0,01 По) взяты из литературы [1].

Рис. 3. Сравнение скоростей эволюции различных белков с медианной

Выводы:

  1. Скорость эволюции транскрипционного фактора Oct4 в 1,68 раз больше скорости для белка Klf4.
  2. Скорость молекулярной эволюции исследуемых белков меньше медианной, что подтверждает их структурную и функциональную консервативность.

Заключение

Полученные результаты исследования дают полноценное обоснование использования других видов животных в рамках таксона млекопитающих для проведения научно-исследовательских работ в этой области и применения белков данных животных для перепрограммирования клеток взрослого организма.

Проделанное исследование — первый шаг в большой работе по изучению параметров транскрипционных факторов. На основании полученных данных о белках Klf4 и Oct4, можно начинать исследования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих эти белки. Зная горячие точки мутирования и ГЦ-насыщенность генов KLF4 и Oct4 можно смоделировать искусственный ген транскрипционный факторов Klf4 и Oct4, который смог бы повысить эффективность перепрограммирования в связи с повышением стабильности мРНК-продукта.

Литература:

  1. Бутвиловский В. Э. Молекулярная эволюция: материалы к факультативному курсу / В. Э. Бутвиловский, А. В. Бутвиловский, Е. А. Черноус. — Мн.: БГМУ. — 2012. — С. 36–40, 75.
  2. Льюин Б. Гены / Б. Льюин. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012. — С. 650-674.
  3. Бутвиловский, А. В., Черноус, Е. А. Методы определения характера аминокислотных замен: учеб.-метод. пособие / А. В. Бутвиловский, Е. А. Черноус. — Мн: БГМУ, 2008. — 28 с

Обсуждение

Социальные комментарии Cackle